[發(fā)明專利]一種豬流行性腹瀉重組腺病毒疫苗的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110437291.7
• 申請(qǐng)日: 2011-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN102512693A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉德輝;何俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州自遠(yuǎn)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K39/225;A61P31/14;C12N7/01;C12N15/50;C12N15/63
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

1.一種豬流行性腹瀉重組腺病毒疫苗的制備方法，其特征在于所述方法是PEDV?S1區(qū)基因插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV上，并與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1同源重組，重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)線性化，轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞后，得到重組腺病毒rAd-S1，經(jīng)鑒定、濃縮、純化、擴(kuò)增步驟，制備成重組腺病毒疫苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬流行性腹瀉重組腺病毒疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）PEDV?S1區(qū)基因的獲得：根據(jù)PEDV韓國(guó)最新分離毒株（序列號(hào)GU180145.1）的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列如下：

S1區(qū)-P1：SEQ?ID?NO:1；

????S1區(qū)-P2：SEQ?ID?NO:2；

用陽性的PEDV病料，提取其總RNA，以S1區(qū)-P2為特異性引物作RT；然后以cDNA產(chǎn)物為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出S1區(qū)全基因，再進(jìn)行膠回收，連接pMD18-T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化，測(cè)序，獲得了完整的S1區(qū)基因序列；

（2）穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-S1的構(gòu)建：在步驟（1）中的上下游引物的5'端分別引入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，通過雙酶切，把S1基因克隆到穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV中，通過轉(zhuǎn)化、PCR和酶切鑒定，獲得含有S1區(qū)基因的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-S1；

（3）重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-S1的構(gòu)建：將步驟（2）鑒定含有S1區(qū)基因的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-S1用PmeⅠ酶切線性化后回收，轉(zhuǎn)化至已轉(zhuǎn)入腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組；通過卡那霉素篩選獲得重組腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)PacI酶切鑒定，將其中陽性重組腺病毒質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化XL10-Gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，以擴(kuò)增重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-S1；

（4）重組腺病毒rAd-S1的獲得與鑒定：?鑒定好的重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)過PacⅠ酶切線性化后回收，轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞內(nèi)，重組腺病毒DNA在細(xì)胞內(nèi)包裝成完整的重組腺病毒rAd-S1；通過純化、擴(kuò)增后，采用PCR、RT-PCR、IFA、SDS-PAGE和Western?blot方法檢測(cè)S1目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)；

（5）豬流行性腹瀉重組腺病毒疫苗的制備：取步驟（4）重組腺病毒，接種于AD-293細(xì)胞其已長(zhǎng)至80-90%滿度，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80-90%時(shí)，收集病毒，經(jīng)反復(fù)凍融3次、間隔至少30min，即可獲得PEDV重組腺病毒rAd-S1疫苗，經(jīng)檢測(cè)、分裝、包裝后而成。