[發明專利]一種磁珠富集法開發菜豆SSR引物的制備方法

有效

• 申請號: 201110437094.5
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102533727A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 汪愛華;周國林;林處發;丁毅;胡偵華;黃興學;鄧耀華;王斌才;姚芳
• 申請（專利權）人: 武漢市蔬菜科學研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種磁珠富集法開發菜豆SSR引物的制備方法，包括下列步驟：

A、菜豆基因組DNA的提取：

選取菜豆品種，按照常規的栽培管理和肥水措施種植，小苗長出5-6片葉子，取嫩葉0.4克利用CTAB法提取基因組DNA；

B、提取基因組DNA濃度的檢測：

提取基因組DNA的濃度用分光光度計檢測，進行SSR引物開發的基因組DNA濃度要達到100ng-1ug/ul；

C、酶切基因組DNA：

用Mse?I對菜豆基因組DNA進行酶切，利用AFLP擴增原理在酶切片斷的兩端加上單鏈寡核苷酸接頭，并用與接頭配套的接頭引物進行PCR擴增放大，創建基因組PCR文庫，對文庫進行純化；

D、Mse?I酶切片段加接頭：

酶切DNA產物用Mse?I接頭：接頭序列Oligo-MseI?A5-TACTCAGGACTCAT-3’，Oligo-Mse?I?B?5-GACGATGAGTCCTGAG-3’加T4?DNAligase進行連接，混勻后，置16℃恒溫水浴鍋溫浴過夜，然后放在4℃冰箱中保存備用；

E、酶切連接的PCR預擴增：

以步驟D酶切連接好的產物為模板，以MseI-N：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’為引物進行PCR擴增，反應條件：第一步1個循環，94℃5min，第二步18個循環，94℃1min，53℃1min，72℃1min，第三步1個循環72℃10min，4℃保存，反應產物使用1％W/V瓊脂糖電泳檢測；

F、PCR預擴增產物與生物素探針雜交：

在66-70℃下使得PCR文庫與所選用的生物素標記的重復序列探針進行雜交；磁珠的表面包被有一層鏈霉親和素，生物素標記的探針與含重復序列單元的DNA片斷雜交結合以后，通過洗滌過程并用磁場固定，在變性條件下含重復序列的微衛星DNA被TE緩沖液洗脫；將洗脫液純化以后作為DNA模板；

雜交體系總體積為100μL，總共平行配制2管分裝，進行雜交，在PCR儀上進行，反應程序為95℃變性5min；雜交66-70℃下保持1-2h，雜交反應完畢后往反應體系中加入300μL?TEN100溶液，混勻后置于4℃保存備用，將加有300μL?TEN100的雜交混合液加入到經過預處理的磁珠中，室溫上放置30min，然后對雜交的磁珠進行洗脫，SDS溶液于室溫下洗滌磁珠3次，每次5min，三次漂洗后再用400μL預熱至55℃的0.2×SSC+0.1％SDS溶液洗滌1次，加入50μL?TE8.0，用移液器吸打均勻，然后于95℃下水浴5min，凍存于-20℃，取得目的DNA片段，以洗脫產物為底物，以MseI-N為引物，用純化后的5μL目的DNA洗脫片段用于PCR擴增，擴增條件與上面的PCR預擴增條件一致，擴增30個循環；

G、連接轉化克隆：

將純化后的PCR擴增產物連接到T載體上進行克隆，操作依照pMD?18-T載體連接，連接反應體系為10μL，連接條件為16℃1hr，于-70℃冰箱中取出一管感受態細胞，置于冰浴中融化，加入5μL連接產物，冰浴30min，冰浴結束后42℃熱激90sec，再冰浴5min，然后加入1mL預冷的液體LB培養基，于37℃的搖床上復蘇培養45min，復蘇培養結束后于4℃10000rpm離心1min，以沉淀細胞；去上清，剩余200-300μL培養基重懸細胞，往每個LB平板上加入4μLIPTG和40μL?X-gal，涂布均勻，每100μL菌液涂一個平板，待液體吸收完畢后，將平板倒置于37℃過夜；

H、陽性克隆的挑取、培養、篩選和測序：

挑選陽性克隆用載體通用引物測序，得到的插入片斷的DNA序列，挑選出微衛星DNA序列，將培養好的平板在4℃放置，使菌落顯色，用無菌牙簽挑取白色克隆到500μL液體培養基中，37℃搖床上以200rmp轉速培養過夜，4℃保存菌液；

取1μL菌液用于PCR模板，擴增條件為：95℃5min；94℃40s；54℃30s；72℃1min；循環30次；72℃7min。取2μL產物于1％W/V瓊脂糖凝膠上電泳，用全自動凝膠成像分析系統記錄電泳結果；

將含有插入片段并且大小的陽性克隆取一半菌液測序，另一半加入20％V/V菌甘油，混勻后于-70℃凍存備份，用M13+通用引物測序，測序在ABI?3730XLDNA?Sequencer上進行，所用反應試劑為ABI?PRISM?BigDyeTM?Terminator?Cycle?Sequencing?Ready?Reaction?Kit，每反應的有效長度達700-800bp，用M13引物從另外一段進行測序，并將正反向測序結果進行拼接；

J、序列分析和微衛星位點的分類與設計：

用軟件SSRHunter從得到的序列中查找出含有重復單元的微衛星序列，測序，根據Weber提出的標準將微衛星分為3類：完美型，指沒有中斷的或附近沒有其它種類重復序列的重復序列；非完美型，指2個或以上的同種重復序列被3個堿基以下的非重復序列所間隔；復合型，指一種重復序列與其它種類的重復序列被3個以下的非重復序列所間隔，將挑選出的微衛星序列去除載體序列，在序列上標記出Mse?I接頭的位置，再用引物設計軟件Primer?Premier?5.0在兩端接頭和核心重復區域之間設計正向和反向PCR擴增引物，用于相應位點的PCR擴增；

K、微衛星引物檢驗：

對每個位點引物的有效性合多態性進行篩選，得到有效的微衛星位點，挑選兩個DNA模板對所有合成的引物進行PCR擴增，退火溫度使用設計引物時的默認溫度為50-62℃，微衛星PCR擴增反應體系為15μL，擴增條件為：94℃5min；94℃40s，Tm?30s，72℃40s，35cycles；72℃7min，PCR擴增產物按照5：1以體積比例加入上樣緩沖液，95℃變性5分鐘后置于冰上，在8％變性聚丙烯酰胺凝膠上加樣檢測，在上樣的同時往其中一個加樣孔加入0.1gPBR322/Msp?I?Marker，正常擴增的引物對用挑選出的DNA模板在退火50-62℃下進行PCR擴增的結果在聚丙烯酰胺膠上電泳的結果讀帶，選擇帶型清晰，至少有兩個或兩個以上等位基因的引物篩選出來。