[發(fā)明專利]一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110436265.2
• 申請(qǐng)日: 2011-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN103173507A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊曉輝;葉昀;林克;王洪森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波林葉生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/04
• 分類號(hào): C12P19/04;C12R1/46
• 代理公司: 上?？剖⒅R(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

1.一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟：

(1)以馬鏈球菌獸疫亞種為出發(fā)菌，經(jīng)過亞硝基胍誘變及原生質(zhì)體紫外誘變，選育得到不產(chǎn)β-溶血素及透明質(zhì)酸酶且產(chǎn)透明質(zhì)酸能力大大提高的遺傳特性穩(wěn)定的突變株，將其在斜面種子培養(yǎng)基上于32～38℃的溫度培養(yǎng)18～24h后，接種至一級(jí)種子培養(yǎng)基中；

(2)將培養(yǎng)好的一級(jí)種子培養(yǎng)液接種至二級(jí)種子培養(yǎng)液中，于32～38℃下培養(yǎng)6～12h至該培養(yǎng)液中的菌群處于指數(shù)生長期的前期；

(3)將培養(yǎng)好的種子液接種至營養(yǎng)度較高的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌體在下列條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)：采用補(bǔ)料分批發(fā)酵，發(fā)酵液pH為5.0～9.0，溫度為32～38℃，攪拌轉(zhuǎn)速150～600rev/min，通氣量1.0～15.0vvm，培養(yǎng)時(shí)間18～24h；

(4)結(jié)束發(fā)酵，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至提取儲(chǔ)罐中，邊攪拌邊用20％三氯乙酸調(diào)pH值至3.0，靜置過夜，用板框進(jìn)行過濾并收集濾出液，然后用去離子水調(diào)節(jié)溶液中透明質(zhì)酸的含量約為5g/L，測定該溶液的pH值，用2N的NaOH溶液將該溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0～9.0；

(5)以10～100g/L的添加量加入特定型號(hào)的硅藻土并攪拌2h，用不銹鋼板框進(jìn)行過濾，收集濾出液；

(6)將另一種特定型號(hào)的硅藻土按照10～100g/L的添加量加入到上述濾出液中，攪拌2h，用不銹鋼板框過濾，并收集濾出液；

(7)將1～10g/L的活性炭加入上述濾出液中，攪拌2h后用板框過濾并收集濾出液；

(8)取樣測定單位體積的濾出液中透明質(zhì)酸的含量，然后按照2∶1(質(zhì)量比)的比例添加一定濃度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，邊加邊攪拌，全部加完后，繼續(xù)攪拌2h；

(9)將上述混懸液進(jìn)行板框過濾并得到沉淀；

(10)配置0.2～1.0mol/L的NaCl溶液，然后將上述沉淀用該氯化鈉溶液溶解，溶解過程要不斷攪拌，以加速溶解速率；

(11)將上述完全溶解后的溶液加入1～10g/L濃度的活性炭，攪拌2h后板框過濾并收集濾出液；

(12)將上述濾出液通過孔徑為0.22μm的濾膜過濾除菌，收集濾出液；

(13)往上述濾出液中加入2～3倍體積的95％乙醇溶液，攪拌使原溶液中的透明質(zhì)酸沉淀出來，至不再有沉淀產(chǎn)生時(shí)進(jìn)行板框過濾，收集沉淀至潔凈容器中，用95％乙醇洗2～3次，然后將沉淀放置于真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥；

(14)收集干燥后的產(chǎn)品并進(jìn)行粉碎即得到最終的產(chǎn)品透明質(zhì)酸鈉。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(1)中的選育方法為：以一株馬鏈球菌獸疫亞種為出發(fā)菌株，采用在平板培養(yǎng)基中添加1～10％無菌綿羊血或0.01～0.1％透明質(zhì)酸鈉的篩選手段，經(jīng)過亞硝基胍誘變及原生質(zhì)體紫外誘變育種技術(shù)，篩選得到表達(dá)量高、不產(chǎn)β-溶血素及透明質(zhì)酸酶且遺傳特性穩(wěn)定的突變菌株。