[發(fā)明專利]一種能夠催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110435897.7
• 申請(qǐng)日: 2011-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN102533682A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 豆俊峰;丁愛中;王鴻婷;李帥冉;杜勇超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/00
• 分類號(hào): C12N9/00;C12R1/01
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)與難降解有機(jī)污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種能夠催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶。?

背景技術(shù)

多環(huán)芳烴(Polycyclic?Aromatic?Hydrocarbons，PAHs)是一類含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的有毒有機(jī)污染物，具有強(qiáng)烈的致癌作用、致畸作用和致突變作用。PAHs能通過生物累積及食物鏈的傳遞作用對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害，已引起各國(guó)環(huán)境科學(xué)家的高度重視。美國(guó)環(huán)保局早在80年代就已把16種未帶分支的PAHs確定為環(huán)境中的優(yōu)先污染物，我國(guó)也把PAHs列入環(huán)境污染的黑名單中。?

目前對(duì)環(huán)境中多環(huán)芳烴的治理技術(shù)主要有物理法、化學(xué)法和生物法。物理處理技術(shù)主要存在處理費(fèi)用高與去除不徹底的缺點(diǎn)。在化學(xué)法中國(guó)內(nèi)外有學(xué)者利用有機(jī)溶劑(如乙醇、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮)及表面活性劑等洗脫環(huán)境中的多環(huán)芳烴，但會(huì)存在二次污染等問題。生物法具有操作簡(jiǎn)單、運(yùn)行費(fèi)用低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，隨著多環(huán)芳烴苯環(huán)數(shù)量的增加，其降解速率降低。因此，低分子量的多環(huán)芳烴在環(huán)境中能較快被降解，在環(huán)境中存在的時(shí)間較短，而高分子量的多環(huán)芳烴，例如苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘等則難于降解，較長(zhǎng)期存在于環(huán)境中。從降解微生物細(xì)胞中提取降解酶來(lái)強(qiáng)化降解已成為去除多環(huán)芳烴污染的一種重要方法。降解酶在多環(huán)芳烴降解的應(yīng)用中具有降解效率高、作用底物濃度低及環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，由于對(duì)多環(huán)芳烴降解微生物缺乏深入的研究，國(guó)內(nèi)外缺少高環(huán)多環(huán)芳烴降解酶方面的研究報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種能夠催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶。所述能夠催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶由潘多拉菌Pandoraea?sp.的菌液經(jīng)過提取與純化得到的。該酶在進(jìn)行催化降解茚并[1，2，3-cd]芘時(shí)，適宜pH值為6.0～8.0，最適宜pH值為7.0，當(dāng)pH值小于4及大于10時(shí)容易失活變性，適宜反應(yīng)溫度為30～45℃，最適宜反應(yīng)溫度為35℃，當(dāng)溫度高于50℃易于失活變性，濃度為1mmol/L的Cu²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺離子對(duì)酶的活性有較強(qiáng)抑制作用。?

分離能夠催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶所用的菌株潘多拉菌Pandoraea?sp.在2010年01月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該中心位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為CGMCC?NO.3615。從潘多拉菌Pandoraea?sp.中分離能夠催化降解茚并[1，2，3-cd]芘的酶具體方案為：?

①向加入198ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2.0ml微量金屬液和0.2ml維生素c溶液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種保?藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的菌株潘多拉菌Pandoraea?sp.；然后用透氣膜密封瓶口，將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)溫度為25～28℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)40d后即可得到擴(kuò)增培養(yǎng)后的菌液；?

②將步驟①中的菌液進(jìn)行超聲波破碎15min；破碎后的菌液在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；?

③向由步驟②分離出的菌體中加入30ml去離子水，繼續(xù)進(jìn)行超聲波破碎15min，在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；?

④向由步驟③分離出的菌體中加入30ml去離子水，繼續(xù)進(jìn)行超聲波破碎15min，在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；?

⑤合并由步驟②、③和④所收集的上清液，即可得到酶粗提液；?

⑥向由步驟⑤得到的酶粗提液中加入碾細(xì)的(NH₄)₂SO₄固體至65～70％飽和度，在轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中振蕩1～2h，然后在8000r/min條件下離心15min，分離出沉淀；?

⑦將由步驟⑥得到的沉淀溶于少量pH值為7.0～7.2的0.05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液并裝入透析袋中，將透析袋在pH值為7.0～7.2的0.05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液中透析24h；將透析后的樣品在8000r/min條件下離心15min，分離出上清液；?