[發明專利]克雷伯氏肺炎桿菌的基因重組方法

無效

• 申請號: 201110435825.2
• 申請日: 2011-12-22
• 公開（公告）號: CN102517320A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 郝健;魏東;史吉平;姜標
• 申請（專利權）人: 上海中科高等研究院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/87;C12R1/22
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 高月紅

1.一種克雷伯氏肺炎桿菌的基因重組方法，其特征在于：包括步驟：

1)克隆Red重組酶基因，連接于pDK6質粒的多克隆位點，命名為pDK6-red質粒；

2)將pDK6-red質粒電擊轉化入克雷伯氏肺炎桿菌細胞中；

3)制備用于第一位點基因重組的DNA片段，該片段的兩端含有與第一目的重組序列兩端同源的同源臂，同源臂內側連接抗性標記I基因；

4)制備含有pDK6-red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞，培養過程中在培養基中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，誘導Red重組酶的表達；

5)將用于第一位點基因重組的DNA片段，通過電擊轉化進入制備好的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞；

6)將轉化后的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞進行培養，通過所述的抗性標記I，篩選得到重組菌株。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括：步驟6)篩選得到的重組菌株能夠再次進行第二位點基因重組，其制備過程包括：

a、采用抗性標記II基因，制備用于第二位點基因重組的DNA片段，該片段的兩端含有與第二目的重組序列兩端同源的同源臂，同源臂內側連接抗性標記II基因；

b、制備所述步驟6)的重組菌株的感受態細胞，培養過程中在培養基中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，誘導Red重組酶的表達；

c、將用于第二位點基因重組的DNA片段，通過電擊轉化進入制備好的感受態細胞中；

d、將轉化后的感受態細胞進行培養，通過所述的抗性標記II，篩選雙位點重組菌株。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟3)、步驟a)中，基因重組的DNA片段同源臂的長度在300-2000堿基對范圍。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟3)、步驟a)中，基因重組的DNA片段同源臂的長度在400-700堿基對范圍。

5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的抗性標記I、II基因，包括：安普霉素、鏈霉素、四環素或氯霉素抗性基因。

6.如權利要求2所述的方法，其特征在于：還包括：采用不同于抗性標記I基因和抗性標記II基因的抗性標記基因，包括：安普霉素、鏈霉素、四環素或氯霉素抗性基因，重復a-d的步驟，獲得多個位點的重組菌株。

7.一種消除克雷伯氏肺炎桿菌重組菌株中抗性標記基因的方法，其特征在于：包括：

1)克隆Red重組酶基因，連接于pDK6質粒的多克隆位點，命名為pDK6-red質粒；

2)克隆Flp重組酶基因，連接于pDK6質粒的多克隆位點，命名為pDK6-flp質粒；

3)將pDK6-red質粒電擊轉化入克雷伯氏肺炎桿菌細胞中；

4)制備用于基因重組的DNA片段，該片段的兩端含有與目的重組序列兩端同源的同源臂，同源臂內側連接抗性標記基因，抗性標記基因兩端添加FRT序列；

5)制備含有pDK6-red質粒的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞，培養過程中在培養基中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，誘導Red重組酶的表達；

6)將用于基因重組的DNA片段，通過電擊轉化進入制備好的克雷伯氏肺炎桿菌感受態細胞；

7)將轉化后的感受態細胞進行培養，通過所述的抗性標記，篩選重組菌株；

8)通過抗性篩選獲得的重組菌株進行傳代培養，利用卡那霉素抗性平板篩選pDK6-red質粒丟失菌株；

9)pDK6-red質粒丟失菌株中，電擊轉入pDK6-flp質粒，傳代培養，利用步驟4)所述的抗性標記，挑選抗性標記基因消除的菌株。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于：還包括：10)所述抗性標記基因消除的菌株，通過傳代培養，利用卡那霉素抗性平板，篩選pDK6-flp質粒丟失菌株；

所述pDK6-flp質粒丟失菌株，還能作為出發菌株，再次進行基因同源重組操作。

9.如權利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟4)中，抗性標記基因，包括：安普霉素、鏈霉素、四環素或氯霉素抗性基因；

FRT序列，如SEQ?ID?NO.1所示；

10.如權利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟9)中，挑選抗性標記基因消除的菌株，包括，通過多個位點的基因重組獲得的具有多個抗性標記基因的重組菌株，能通過pDK6-flp質粒，將多個抗性標記基因同時消除。