[發明專利]野生型和突變體hFⅨ畢赤酵母表達載體及構建方法和應用

無效

• 申請號: 201110435501.9
• 申請日: 2011-12-22
• 公開（公告）號: CN103173482A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 張同存;周俊;王震宇;戴永剛;成彩蓮;唐文心
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C07K14/745;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于分子生物學領域。更具體涉及一種野生型人凝血因子IX(hFIX)和三種hFIX高活性突變體在畢赤酵母中的高效表達載體，同時還涉及一種野生型人凝血因子IX(hFIX)和三種hFIX高活性突變體在畢赤酵母中的高效表達載體的構建方法。還涉及這些高活性突變體的序列。還涉及一種野生型人凝血因子IX(hFIX)和三種hFIX高活性突變體在畢赤酵母中的高效表達載體的用途，一種畢赤酵母表達的野生型hFIX產品(SMD1168-pPIC9K-hFIX)的中試發酵工藝中的應用。?

背景技術

凝血因子Ⅸ研究進展：?

凝血因子IX是凝血“瀑布反應”中重要的促凝集因子。其主要由肝實質細胞合成，以酶原的形式分泌到外周血中。當各種內外因素激活內源性凝血反應后，凝血因子IX被激活，發生一系列的凝血連鎖反應，最終形成血塊、血栓，從而達到止血的目的。凝血瀑布反應中內源性凝血途徑由因子XII活化而啟動。當血管受損，內膜下膠原纖維暴露時，可激活XII為XIIa，進而激活XI為XIa。XIa在Ca2+存在時激活IXa(活化的hFIX)，IXa再與激活的Ⅷa、PF3、Ca2+形成復合物進一步激活因子X。Xa與因子V、Ca2+和PF3(血小板第3因子，為血小板膜上的磷脂)共同組成凝血酶原復合物，最終啟動凝血酶和纖維蛋白的形成。當某些指導凝血因子IX合成的基因發生各種突變時，凝血因子IX不能正常合成，或合成量減少，或活性下降，都會使得內源性的凝血反應受到不同程度的影響，從而導致活化的部分凝血酶時間(Activated?Partial?Thromboplastin?Time，APTT)時間延長，引發一系列的凝血功能異常。這種疾病就是人類B型血友病(Hemophilia?B)。?

人類B型血友病，又稱凝血因子IX缺乏癥(Factor?IX?Deficiency)、克里斯多式癥(Christmas?Disease)。它是一組由于缺乏凝血因子IX所引起的性連鎖隱性遺傳性疾病，X染色體隱性遺傳，因而常見于男性。導致B型血友病的發生主要是因為指導合成凝血因子IX的基因發生了插入、倒位、缺失和點突變等異常，直接的后果就是合成的凝血因子IX量減少或活性降低，或者兩者兼備。根?據凝血因子IX活性相當于標準活性的百分比(hFIX∶C)，可以分為輕、中和重型血友病。?

臨床上治療重型B型血友病的方法常見的就是凝血因子IX輸入替代療法和基因治療，由于基因治療存在著副作用大、效果不佳的缺點，在臨床應用上仍屬于試驗階段，所以常用的治療方法主要是凝血因子補充替代療法。臨床實踐證明，補充所缺乏的凝血因子是控制血友病出血最有效的措施。替代療法的原則是根據hFIX的半衰期、穩定性，以及出血嚴重程度、手術大小及范圍，有針對性地選擇合適的血液制品、劑量和給藥方法。替代療法包括輸入新鮮血漿(已不常用)、冷沉淀物凝血酶原復合物(含因子IX、X、II、Ⅶ)和基因工程生產的hFIX藥物(如BenefIX)等。但是血漿和血漿提純的凝血因子的安全性受到了很大的質疑，反復輸入很容易感染HIV、HBV、HCV和梅毒等，有報道稱有5％左右的血友病人因輸血引起各種感染。所以應用重組凝血因子是一個很好的選擇，它避免了感染的隱患，但其高昂的價格和國內重組hFIX藥品短缺使得病人在用藥上很不便。?

hFIX的編碼基因位于X染色體長臂末端，大小約為10kb，轉錄的mRNA大小約為2500bp。hFIX主要是由肝臟實質細胞合成的，細胞合成的hFIX由461個氨基酸殘基組成，血液中游離的hFIX由不帶信號肽片段的415個氨基酸殘基組成。hFIX是單鏈糖蛋白，含有約17％的糖基化修飾，分子大小根據糖基化程度不同為55-75kD。當發生內源性凝血時，其轉化為活化的hFIX(hFIX?a)。hFIX?a由一個輕鏈和一個重鏈組成，具有絲氨酸蛋白酶活性。血液中凝血因子IX的正常濃度為3-5mg/L。?

從已有的資料看，大部分報道的hFIX突變都會引起其活性的降低，從而罹患B型血友病。點突變也是B型血友病遺傳學上的病理機制之一。但是，也有報道某些氨基酸的改變會增強其凝血活性。例如在輕鏈Gla區域的第86氨基酸V(纈氨酸)突變為A(丙氨酸)時，特異性凝血活性會增高至原來的2倍，原因可能是由于加強了和活化態凝血因子IX的結合的能力；在輕鏈EGF-2區域的V107突變為A時，和活化態凝血因子Ⅷ的結合能力是野生型的36倍左右，因此懷疑能提高凝血因子IX的活性。因此，我們選擇了這兩個突變位點對hFIX進行突變研究。?

畢赤酵母表達載體研究進展：?