[發明專利]真皮等同物的構建方法

有效

• 申請號: 201110434821.2
• 申請日: 2011-12-22
• 公開（公告）號: CN102499998A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 史明艷;高雪;楊學義;華進聯;易力;任紅艷;張路陪;高會江;李俊雅;許尚忠;竇忠英
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60;A61L27/36;A61L27/24
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 陳大通

技術領域

本發明屬于生物組織工程技術領域，具體涉及一種以人羊膜和膠原凝膠為支架，構建真皮等同物的方法，即一種真皮等同物的構建方法。

背景技術

1975年Rheinwald和Green發明了上皮培養技術，使得人工表皮的合成成為可能。但是，人工表皮只能用于表皮損傷和表皮及淺層真皮損傷，當全層或接近全層真皮損傷時，容易形成創面攣縮、傷疤或開放性創口。因此，研究開發真皮替代物又成為臨床的需求。

目前，人工合成真皮主要采用膠原-氨基葡聚糖、膠原凝膠、聚羥基乙酸、尼龍網等作為真皮支架。例如：Biobrane外層為硅膠膜，內層為部分埋入其中的尼龍纖維網，網孔中充滿化學交聯的豬真皮Ⅰ型膠，以促進其與創面的粘附和纖維血管的長入。硅膠膜為半通透性的膜，其透氣透水性能較正常皮膚稍強，有利于藥物局部滲透及減少局部積液；另一方面可以減少體內水分的丟失。Dermagraft-TM則使用可降解的聚羥基乙酸作為真皮支架，移植后支架成分逐漸被降解，種植的Fb則產生新的真皮基質。臨床證明，Demagraft可有效用于糖尿病潰瘍的治療。Integra是由Burke和Yannas根據材料科學和工程學原理設計的一種真皮替代品，它是利用膠原纖維和硫酸軟骨素構成多孔支架。?

單純以膠原凝膠為支架制作的人工真皮時，隨著真皮成纖維在凝膠內擴增并通過分泌自身的膠原和其他蛋白，形成新的真皮基質的同時，出現較明顯的收縮，收縮的程度與膠原的濃度、凝膠成分及細胞密度有關。?Eun?Kyung?Yang等在用膠原凝膠做人工皮膚時，為降低膠原凝膠的收縮性，篩選了最佳細胞密度和最佳凝膠濃度，同時為了增加手術的可操作性，在膠原的下面制作了膠原網格來增加人工皮膚的韌性。然而，利用生物膜做支架，制作真皮等同物在國內外研究領域還屬空白，本發明是以經過處理的人羊膜和牛Ⅰ型膠原為支架制作真皮等同物。

發明內容

本發明的目的是針對現有以膠原凝膠制作真皮等同物存在的收縮率較高的缺陷，提供一種以人羊膜和膠原為支架的真皮等同物的構建方法。本發明技術方案是以人羊膜做支架，將一定濃度的真皮成纖維細胞和凝膠混合后，滴加到人羊膜上，人羊膜能有效地阻止膠原凝膠的收縮，而且使用人羊膜做支架，在移植時可有效防止真皮等同物的撕裂，增加手術的可操作性，并且術后人羊膜和生物體組織有很好的相容性，在移植初期可以吸取生物體一些營養成分，促進皮膚的愈合。

為了解決上述問題，本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種真皮等同物的構建方法，所述構建方法包括以下步驟：

a、人羊膜的無菌處理：

預處理：取自剖腹產分娩產婦的胎盤，并檢測胎盤的HIV、甲肝、乙肝以及梅毒血清學反應顯示為陰性，將經過檢測后的胎盤放入加有三抗的生理鹽水中進行浸泡消毒，浸泡消毒的時間為3～4小時；

海綿層的去除：在無菌間內，鈍性剝離附著在預處理后胎盤上的人羊膜，將剝離下的人羊膜用加有三抗的生理鹽水反復沖洗，沖洗至血液及其它污物徹底洗掉，再用含三抗的PBS緩沖液沖洗人羊膜2～5遍，沖洗后鈍性剝離人羊膜上的海綿層；

上皮細胞的去除：將去除海綿層的人羊膜用含三抗的PBS緩沖液沖洗1～3遍，然后將人羊膜分成數小塊，上皮面向上分別平鋪于玻璃平皿內，加入0.25%胰酶＋0.02%?EDTA溶液，在4℃條件下冷消化12～20?h，將冷消化后的人羊膜用細胞刮去除上皮細胞，然后放入常規的DMEM培養液中培養2～5?min，再用含三抗的PBS緩沖液沖洗3～5遍，得到無菌處理后的人羊膜；

b、人羊膜支架的制作：將硝酸纖維素膜剪成中空的正方形，放于塑料袋內密封，密封后進行5～15磅高壓消毒，消毒后待用；將步驟a無菌處理后的人羊膜基底面向上平鋪于玻璃皿內，將處理好待用的硝酸纖維素膜附于其上，然后翻轉，使其上皮面向上放入另一玻璃皿內，于恒溫箱內進行干燥，干燥后得到人羊膜支架；

c、真皮成纖維細胞的制備：取奶山羊耳部皮膚樣本0.5×0.5cm²，刮去皮膚表面贓物，用質量百分濃度為75％的酒精消毒2～4次，然后用常規D-Hank's液沖洗3～5次，每次沖洗5min，將消毒沖洗后的皮膚樣本去除表皮層，將所得真皮層剪成糜狀，然后加入3～5ml、質量百分濃度為0.25%的胰酶，在37℃條件下消化5～10min，消化后過濾離心收集細胞，將收集的細胞接種培養皿中，用含有質量濃度10%血清的DMEM培養液進行培養，培養3～4天，每2天換液一次，培養后得到真皮成纖維細胞；