[發明專利]添加抗氧化劑CAT和VE制備家畜性控冷凍精液的方法

有效

• 申請號: 201110433773.5
• 申請日: 2011-12-22
• 公開（公告）號: CN102578074A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 王麗霞;蘇杰;孫偉;郭繼彤;周文忠;胡樹香;丁瑞;李喜和
• 申請（專利權）人: 內蒙古賽科星繁育生物技術股份有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于動物繁殖技術領域，主要提供通過添加過氧化氫酶(CAT)和維生素E(V_E)，有效保護家畜精子分離、冷凍過程中精子生理機能，提高精子解凍后活力與延長精子存活時間，從而制備能夠正常受精受胎的家畜性控冷凍精液的方法。

背景技術

家畜精子分離-性控技術從2000年產業化以來，目前已經在全世界十余個國家推廣應用。但是，在實際生產中，與普通家畜冷凍精液相比，由于性控凍精要經過離心、染色、分離過程，造成對性控精子的損傷，影響性控凍精解凍后的活力與存活時間，并導致性控凍精受胎率低下的問題。為了提高性控凍精的品質，研究開發了該性控凍精生產方法。

發明內容

本發明提供了一種添加抗氧化劑CAT和V_E制備家畜性控冷凍精液的方法，該技術原理是利用抗氧化劑CAT和V_E能夠抵抗攜帶有自由基的活性氧族(ROS)特點，在精子分離、冷凍的過程中添加CAT和V_E，降低活性氧族對精子造成的過氧化損傷的作用，從而提高解凍后精子活力和延長精子存活時間，提高性控凍精產品質量達到受精受胎目的。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種添加抗氧化劑CAT和V_E制備家畜性控冷凍精液的方法，它包括以下步驟：

(1)、CAT液和V_E液的配制：

室溫下稱取4.2mg的CAT加入1ml的蒸餾水中溶解，避光保存在-20℃，保存期限為一周；稱取4mg的V_E加入1ml的DMSO中溶解，避光保存在4℃，保存期限為一周；

(2)、家畜原精的抗生素補加：

按照1ml家畜原精添加6μl林可-奇霉素、6μl泰勒霉素、8μl東大霉素的比例在家畜原精中添加抗生素；

(3)、精子分離：

1)將補加好抗生素的家畜原精用50μm精液過濾器過濾至新的離心管中，除去原精液中的雜質，過濾后使用密度儀檢測原精實際濃度，置18-20℃冰箱中保存；

2)計算六臺分離機用于染色的原精體積數＝六臺分離機每小時分離精子總數12億/原精實際濃度；

3)根據步驟2)計算好的用于染色的原精的體積數，用15ml離心管從步驟1)中取出原精，補加Staining?Talp到3ml，360g離心洗滌，5分鐘；

4)在另一個新的離心管中按照12億原精加入75μl?Hoechst33342熒光染料、加入6ml?Staining?Talp的比例，將Hoechst33342熒光染料和StainingTalp進行混合，并用懸浮振蕩器輕微振蕩3秒，Hoechst33342熒光染料的濃度為5mg/ml；

5)步驟3)離心停止后，吸棄2ml上清液，保留體積1ml，將其轉移至上述步驟4)的15ml離心管中，34℃染色45分鐘后，加入6ml的4％eggyolk；

6)把步驟5)染色處理的原精按每個分離管2億原精進行分裝，把分裝好染色后的原精樣品放入分離機的樣品臺內，分離原精；

7)根據分離機上的讀數記錄每臺分離機的精子分離總數，計算六臺分離機的精子分離總數＝每臺儀器分離數×6(單位：千萬)；

8)從-20℃冰箱中取出的buffer緩沖液中，按照1ml添加5μl?CAT液、1μl?V_E液的比例，添加抗氧化劑CAT液和V_E液，室溫預熱半小時，作為分離后精子的回收液，所說的buffer緩沖液含84％的TrisA冷凍平衡液和16％超純水；分離精子下機后，在4℃條件下平衡90分鐘，850g離心20分鐘后，棄上清液，將精子沉淀，用懸浮振蕩器進行輕微震蕩，震蕩后將所有分離后的精子都倒入一個空離心管中；

(4)、添加抗氧化劑性控凍精的制備：

1)在Tris-A、Tris-B中添加抗氧化劑，添加比例為：1ml?Tris-A分別添加51μl?CAT液、1μl?V_E液，1ml?Tris-B分別添加5μl?CAT液、1μl?V_E液，添加完抗氧化劑后，將Tris-A、Tris-B分別混合均勻，放在4℃條件下平衡90分鐘；