[發(fā)明專利]用雙指示線免疫層析半定量診斷促黃體生成素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110433729.4
• 申請日: 2011-12-22
• 公開（公告）號: CN102565426A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 霍五奎;岳曉燕;馬雪明;劉寅;王晶;羅云萍;張有青
• 申請（專利權(quán)）人: 正元盛邦(天津)生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷促黃體生成素的方法。

背景技術(shù)

優(yōu)生優(yōu)育是計劃生育具體內(nèi)涵的延伸，是新的歷史條件下對計劃生育的具體化體現(xiàn)。我國是人口大國，巨大的人口壓力會制約著社會的發(fā)展，所以做好優(yōu)生優(yōu)育既是提高人口素質(zhì)的重要手段，也是制約人口發(fā)展的重要手段，對未來社會整個民資的發(fā)展有重要的作用。所以大家應(yīng)該要堅持做好優(yōu)生優(yōu)育，為子孫后代的良性發(fā)展創(chuàng)造有利條件。

那么，在計劃生育時為了優(yōu)生優(yōu)育應(yīng)該怎樣做呢？可以從優(yōu)戀、優(yōu)婚、優(yōu)孕三個方面考慮。優(yōu)戀指的是談婚論嫁之前，要注意了解對方及其家庭成員身體健康方面的信息。優(yōu)婚是指在完全知情的情況下結(jié)婚，這一點就要依賴于婚前的體檢。優(yōu)孕，就是在適宜的孕育年齡、最佳的受孕時機懷孕生子，這樣可以最大可能的避開對胎兒發(fā)育不良的不利因素。據(jù)調(diào)查，半數(shù)以上的青年夫婦結(jié)婚以后不采取避孕措施，往往在不知不覺中懷孕。由于事先毫無計劃和準(zhǔn)備，結(jié)果有的發(fā)生了自然流產(chǎn)，有的感染了流感、風(fēng)疹等病毒性疾病，有的使用了孕期應(yīng)當(dāng)禁用的藥物……可見，婚后注意避孕、實行有計劃的自主懷孕很有必要。

促黃體生成素是由垂體前葉分泌的一種糖蛋白激素。在女性體內(nèi)則主要是促進排卵的發(fā)生。促黃體生成激素(LH)是隨女性月經(jīng)周期而含量呈周期性變化的激素，其作用是刺激卵巢內(nèi)成熟卵子的釋放。通常在排卵前36～48小時左右突然大幅度上升，LH達到最高峰值后的12到18小時開始排卵，如未受孕LH迅速下降，重復(fù)下一周期。LH峰值后1-3天時間內(nèi)婦女最易受孕。因此對女體內(nèi)LH的檢測常被用來判斷女性的排卵狀況。

動態(tài)的監(jiān)測掌握LH變化特點，確定LH的峰值及時間，從而可以更準(zhǔn)確的預(yù)測與監(jiān)測排卵情況，為臨床提供更準(zhǔn)確的結(jié)果，指導(dǎo)育齡婦女選擇最佳受孕時機或指導(dǎo)安全期避孕。開發(fā)簡單、快速的促黃體生成素診斷方法具有十分重要的經(jīng)濟價值和社會意義。

免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)在已成功用于電鏡、流式細胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領(lǐng)域。目前金標(biāo)記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗和免疫層析試驗等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個重要發(fā)展方向，是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測(POCT)中得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。

利用膠體金的檢測方法測定尿液中LH作為排卵的考察檢測，已被開發(fā)，其檢測下限為25mIU/ml。但是對于臨床上單獨使用25mIU/ml這一標(biāo)準(zhǔn)不能直接、快速區(qū)分排卵的強弱程度，所以開發(fā)能夠檢測LH?25～50mIU/ml這一LH診斷灰區(qū)的半定量膠體金試紙也是十分必要的。目前國內(nèi)外均無相關(guān)的試紙條出售。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的：開發(fā)簡單、快速的測排卵方法具有十分重要的經(jīng)濟價值和社會價值。本實驗采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測LH的方法。并且能夠半定量檢測25mIU/ml～50mIU/ml這一LH灰區(qū)范圍。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記β-LH抗體并均勻涂布于膠金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個不同濃度的α-LH抗體固定于兩個檢測線(即T線)，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結(jié)果。本發(fā)明方法包括如下步驟：

一、膠體金溶液配制

1.配制1％氯金酸溶液；

2.配制2％檸檬酸三鈉溶液；

3.將0.02％的氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2％的檸檬酸三鈉2mL；

4.溶液由淺藍色，深藍，再加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸10min；

停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。

二、膠體金標(biāo)記物的制備

1.取兩個1.5mL試管，分別加入1mL膠體金溶液；

2.加入適量硼砂緩沖液把pH調(diào)整為8.0；

3.加入20μg/mLβ-LH抗體，使其達到最小蛋白濃度，混勻，振蕩30min；

4.加入20μL的10％BSA，混勻，振蕩30min；