[發明專利]用雙指示線免疫層析半定量診斷鹽酸克倫特羅的方法

無效

• 申請號: 201110433705.9
• 申請日: 2011-12-22
• 公開（公告）號: CN102565407A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 霍五奎;岳曉燕;馬雪明;劉寅;王晶;羅云萍;張有青
• 申請（專利權）人: 正元盛邦(天津)生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明涉及一種生物工程技術領域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷鹽酸克倫特羅的方法。

背景技術

瘦肉精是一類動物用藥的統稱，任何能夠促進動物瘦肉生長、抑制動物脂肪生長的化學藥物均可叫做“瘦肉精”，主要包括鹽酸鹽酸克倫特羅、鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林等。將瘦肉精添加于飼料中，可以增加動物的瘦肉量，減少飼料使用量，促進肉品提早上市，降低成本。但因為考慮對人體會產生副作用，各國的開放使用標準不一。國內由于雙匯瘦肉精事件，使得人們開始關注瘦肉精對于人體的危害。

在我國所指的瘦肉精主要指的是鹽酸克倫特羅。鹽酸克倫特羅是一種平喘藥，一類腎上腺類興奮劑，20世紀80年代初，美國一家公司首先將其作為飼料添加劑使用，增加肉品的瘦肉率。但由于作為飼料添加劑的使用劑量為人用藥劑量的10倍以上，才能達到提高瘦肉率的效果，用量大、使用時間長、代謝慢，在動物宰殺之前到上市，肉品殘留量足以使人體積蓄中毒。如果一次攝入量過大，如烹食豬的肝臟或肺臟器官，就會產生異常生理反應的中毒現象，可導致心悸、心率失常、肌肉震顫、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀，特別是對于高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴重的可導致死亡。任何國家及世界組織均禁止在飼料中添加鹽酸克倫特羅。

我國在2003年出臺了動物性食品中的鹽酸克倫特羅殘留量測定標準，標準號為GB/T5009.192-2003。鹽酸克倫特羅的主要檢測方法為氣相色譜-質譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫吸附法(ELISA)、液相色譜-質譜/質譜法(HPLC-MS/MS)。我國將氣相色譜-質譜法作為檢測鹽酸克倫特羅的確證性方法(NY/T468-2001)，其最低檢測限為2ng/g。以上除ELISA外，均屬于色譜法，主要是利用不同物質在不同相態的選擇性分配，對混合物進行洗脫，混合物中的不同物質會以不同的速度沿固定相移動，已達到分離的效果。需要專門的高效液相色譜儀進行檢驗，價格昂貴且檢測時間較長。而ELISA方法相較于色譜方法，儀器較為便宜，耗時類似，但操作步驟較為繁瑣。

免疫膠體金技術是20世紀70年代初期由Faulk和Taylor始創，最初用于免疫電鏡技術。膠體金標記技術是以膠體金作為示蹤標志物或顯色劑，于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術，現在已成功用于電鏡、流式細胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領域。目前金標記技術常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗和免疫層析試驗等。免疫層析試紙條就是此技術用于體外快速診斷的一個重要發展方向，是在現代單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的新型檢測技術。近年來該技術發展迅速，已經在臨床診斷特別是床邊檢測(POCT)中得到了廣泛應用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。免疫膠體金技術與ELISA技術同屬于免疫學診斷方法，均是依賴于抗原與抗體的特異性反應，但不需要專門的儀器設備，更適于現場及床旁快速檢測。

利用競爭法免疫層析膠體金技術測定肉品中的鹽酸克倫特羅的診斷試劑在市場上尚未有商品化的試劑盒，但已開發，但其僅為定性產品。本發明是運用雙指示線檢測方法，可對所檢測肉品中的鹽酸克倫特羅的含量進行定量檢測，灰區因此，半定量膠體金試紙也是十分必要的。目前國內外均無相關的試紙條出售。

發明內容

本發明的目的：開發簡單、快速的鹽酸克倫特羅方法具有十分重要的經濟價值和社會價值。本實驗采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測Clen的方法。并且能夠半定量檢測1.5ng/mL～3ng/mL這一Clen灰區范圍。

本發明是通過以下技術方案實現的：采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標記抗Clen單克隆抗體并均勻涂布于膠金墊上，作為示蹤標記物。在硝酸纖維素膜上，兩個不同濃度的Clen-BSA偶聯物固定于兩個檢測線(即T線)，羊抗鼠二抗固定于質控線(即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標抗體與相應的抗原、抗體發生特異性結合被截留而顯色，根據T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結果。

本發明方法包括如下步驟：

一、膠體金溶液配制

1.配制1％氯金酸溶液；

2.配制2％檸檬酸三鈉溶液；

3.將0.02％的氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2％的檸檬酸三鈉2mL；

4.溶液由淺藍色，深藍，再加熱出現酒紅色，繼續煮沸10min；

停止加熱，繼續攪拌至室溫。

二、膠體金標記物的制備