[發(fā)明專利]小鼠短串聯(lián)重復(fù)序列的復(fù)合擴(kuò)增體系及檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110433623.4
• 申請日: 2011-12-21
• 公開（公告）號: CN102559878A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳初光;周仲春;呂悅心
• 申請（專利權(quán)）人: 北京閱微基因技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京兆君聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及鑒定小鼠多個短串聯(lián)重復(fù)序列的復(fù)合擴(kuò)增體系及其試劑盒，可以快速準(zhǔn)確進(jìn)行小鼠細(xì)胞STR分型進(jìn)而鑒定小鼠細(xì)胞系類型。

背景技術(shù)

2009年，Nature上的一篇社論指出：在數(shù)以千計的使用細(xì)胞系的生物實(shí)驗(yàn)室中，許多實(shí)驗(yàn)室并不知道介于1/5-1/3之間的常用細(xì)胞系可能已不是原先認(rèn)為的那樣了。過去的25年里，大量的研究，加上美國、英國、德國和日本細(xì)胞庫的經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：18-36％的培養(yǎng)物含有錯誤鑒定的物種或其它細(xì)胞類型。就連管理嚴(yán)格的美國國家癌癥研究所的細(xì)胞庫都出現(xiàn)了細(xì)胞系遭污染的現(xiàn)象。現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室研究人員唯一的辦法是給細(xì)胞驗(yàn)明正身，使用DNA指紋圖譜(STR分型技術(shù))驗(yàn)證所使用的細(xì)胞是否與數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)一致以鑒定身份。Nature雜志社希望這一身份鑒定工作能持續(xù)下去，將主要的無限制增殖的細(xì)胞系(癌細(xì)胞)鑒定完畢。Nature雜志將會要求投稿人為文章中的所有細(xì)胞系提供身份驗(yàn)證。

2010年5月ATCC?SDO(Standards?Development?Organization)工作組在Nature?review?cancer雜志上發(fā)表了題為《Cell?line?misidentification：the?beginning?of?the?end》前瞻性報道。報道指出：細(xì)胞系作為正常或腫瘤組織的模式細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和藥物開發(fā)，然而很大一部分的細(xì)胞系被錯誤標(biāo)記或被其它個體、組織、種系來源的細(xì)胞所替代，由于科學(xué)界無法解決此類問題以致大量因使用錯誤鑒定的細(xì)胞系而導(dǎo)致誤導(dǎo)或存在潛在錯誤的學(xué)術(shù)論文發(fā)表。通過近年來的努力而開發(fā)出的STR分型方法已成為對人源細(xì)胞進(jìn)行鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，STR分型的應(yīng)用成為根除細(xì)胞錯誤鑒定這一問題的重要一步。

STR位點(diǎn)是由不同數(shù)目重復(fù)單元組成的重復(fù)DNA序列。STR分型的原理為在一單管中同時擴(kuò)增多個多態(tài)性DNA片段。每一個STR位點(diǎn)均能被擴(kuò)增且擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記上不同顏色的熒光，使得擴(kuò)增產(chǎn)物很容易通過片段大小和顏色來區(qū)分。STR分型最先應(yīng)用于親緣鑒定、法醫(yī)鑒定、以及鑒定在20年之前的大災(zāi)難中遇難的受害者。隨后，STR分型用于細(xì)胞鑒定中。用STR分型來做細(xì)胞鑒定具有其它方法所不具備的優(yōu)勢：

1.高度豐富信息：同時分析多個STR位點(diǎn)，可以建立每個細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)分型圖譜，便于不同來源細(xì)胞進(jìn)行比對。

2.靈敏度高，能夠檢測1ng或更低的DNA量，能夠檢測早期細(xì)胞污染。

3.分型快速、且結(jié)果穩(wěn)定可靠，易于操作及自動化。

許多方法已被用來檢測細(xì)胞系交叉污染，包括同工酶分析、核型分析、人類白細(xì)胞抗原(HLA)分型，免疫分型和DNA指紋識別。這些方法都可以鑒別出某一種細(xì)胞系，但是分辨能力各不一樣。然而，這些方法在不同實(shí)驗(yàn)室所得到的數(shù)據(jù)卻不盡相同，以致沒有任何一種方法可以用來建立一個標(biāo)準(zhǔn)參考數(shù)據(jù)庫。由于STR分型具有快速、鑒定的細(xì)胞系結(jié)果明確等無以倫比的優(yōu)點(diǎn)，故STR分型的應(yīng)用價值最大。

目前STR分型技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于人源細(xì)胞系的鑒定，并已建立起標(biāo)準(zhǔn)的STRMarker組合，用于鑒定1000多種細(xì)胞。但對于小鼠細(xì)胞系的鑒定，由于沒有成型的多重STR擴(kuò)增體系和相關(guān)的產(chǎn)品，STR分型并未得到廣泛應(yīng)用。

在過去一個世紀(jì)的研究中，小鼠已經(jīng)成為建立人類遺傳性疾病的動物模型的最佳實(shí)驗(yàn)材料，小鼠細(xì)胞系已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。如在疾病研究和疫苗生產(chǎn)方面常用的小鼠細(xì)胞系有A9、3T3、NS-1、J774A.1、CTLL-2、SC-1等多種，是除了人類細(xì)胞外被應(yīng)用數(shù)量最多的動物細(xì)胞，數(shù)量有幾百種。建立小鼠細(xì)胞系的STR分型方法，對于每一位使用小鼠細(xì)胞系的研究者來說無疑是一個福音，也必將極大地促進(jìn)人類健康事業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述領(lǐng)域中的不足和需求，本發(fā)明提供一種鑒定小鼠細(xì)胞系的復(fù)合擴(kuò)增體系，其擴(kuò)增的位點(diǎn)是一些可以用來鑒定小鼠細(xì)胞系的STR位點(diǎn)，在鑒定小鼠細(xì)胞系時，其分型快速、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡單、便于大規(guī)模推廣，這種方法隨著試劑盒開發(fā)成功可以批量生產(chǎn)，使用條件可以模式化，全部過程都有自動化設(shè)備，不再依賴于人的操作經(jīng)驗(yàn)，可以實(shí)現(xiàn)自動化，所需時間短，整個檢測時間需要6小時左右。

小鼠短串聯(lián)重復(fù)序列的復(fù)合擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系中同時擴(kuò)增STR位點(diǎn)D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16和D17Mit51.1。

所述擴(kuò)增體系中還包括性別決定位點(diǎn)Jarid1。