[發明專利]包含免疫球蛋白Fc片段的長效人內皮抑素

在審

• 申請號: 201110433226.7
• 申請日: 2011-12-21
• 公開（公告）號: CN103172745A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 張世奇;劉家望;杜伯雨;馬玉芬;楊亞平;李永平;周筠;連忠輝;文圣煥
• 申請（專利權）人: 北京韓美藥品有限公司
• 主分類號: C07K17/08
• 分類號: C07K17/08;A61K38/39;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 隆天國際知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;任曉華

技術領域

本發明屬于生物制品制藥技術領域，涉及一種長效重組人內皮抑素的制備方法。

背景技術

自Folkman于1971年提出“腫瘤的生長和轉移都依賴于新生血管的生成”[Folkman?J.N?Engl?J?Med?1971；285：1182-1186]的觀點以來，人們就把抑制腫瘤血管生成作為一種研究對象。血管內皮抑素(Endostatin)由美國O′Reilly等人于1997年首先發現。O′Reilly等人在試驗中發現體外培養的鼠血管內皮細胞瘤(EOMA)的細胞培養液能抑制體外牛毛細血管內皮細胞增殖，他們從這種培養液中提純出了一種新的蛋白質，并命名為內皮抑素(Endostatin，ES)。經鑒定表明鼠內皮抑素由膠原蛋白XVIII?C末端區內184個氨基酸片段構成[O’Reily?M?S.et?al.US?005854205A]。我國徐根興等人也于當年在研究內皮抑素工作中發現了人的血管內皮抑素，并從人肝臟cDNA文庫中篩選克隆得到人體血管內皮抑素基因[徐根興等，CN1177005A]。內皮抑素的直接作用是通過抑制血管生長而起到抗腫瘤作用，并且不會導致抗藥性產生。

恩度(Endostar)是我國自主研發的重組人血管內皮抑素(Recombinant?Human?Endostatin，rhES)，于2005年上市，用于非小細胞肺癌的治療。它與天然的血管內皮抑素相比，在N端添加了9個氨基酸序列，提高了生物活性和穩定性。恩度與化療藥物長春瑞賓和順鉑(NP化療方案)聯用有一定的協同作用，可延緩患者的腫瘤進展。但是內皮抑素作為小分子蛋白，性質很不穩定，易于發生酶促降解并被清除，因此在體內的半衰期較短。而且，目前恩度臨床用藥量很大，在聯合NP化療方案用于治療初治或復治的III/IV期非小細胞肺癌患者時，注射劑量為7.5mg/m²，每天靜脈滴注3-4小時，連續給藥14天為一周期。因此，提高rhES的體內半衰期，從而減少治療劑量，降低患者痛苦以提高患者依從性成為一個急需解決的問題。

為了穩定蛋白質、預防酶促降解和被腎臟清除，可以使用諸如聚乙二醇(polyethylene?glycol，PEG)等具有高溶解性的聚合物來化學修飾蛋白質藥物的表面。PEG分子具有兩親性，既可以溶于水，又可以溶于大多數的有機溶劑，無毒、無免疫原性，是可用于藥物制備的高分子之一。通過與靶蛋白質的特定區域或各種區域結合，PEG能夠提高血漿半衰期，增強生物利用度，減低蛋白質免疫原性、提高藥物療效及安全性等。另外，可通過在PEG兩端連接同樣的蛋白質藥物來制備二倍體，以提高蛋白藥物的活性。也可以將兩種不同的蛋白質藥物連接于PEG的兩端，得到具有兩種活性的藥物組合物。

改善蛋白藥物的體內半衰期還可以通過用基因重組技術，將藥物蛋白的基因與編碼具高血清穩定性的蛋白質基因相融合，從而生產融合蛋白藥物。例如將蛋白質藥物與白蛋白或其片段融合，或者與免疫球蛋白Fc片段融合。研究表明，藥物與免疫球蛋白Fc片段融合，可以明顯改善藥物的體內半衰期。

不過，盡管PEG能增強蛋白質的穩定性，PEG偶聯也存在一些問題，如降低蛋白生物學活性。此外，隨著PEG分子量的提高，其產量也會有所降低等等。通過基因重組產生融合蛋白也具有一些缺點。例如，其導致所產生的融合蛋白的活性顯著降低。蛋白質作為生理學功能性物質的活性是由蛋白質的構象決定的。當多肽藥物通過重組方法與免疫球蛋白Fc片段融合時，利用原核細胞進行表達，融合蛋白常常發生錯誤折疊并以包涵體的形式表達；而利用真核細胞表達，免疫球蛋白Fc片段通常會被糖基化，從而可能引起體內的不良免疫應答。融合的接頭區也可能對蛋白水解酶的降解作用敏感等等。

韓國韓美藥品有限公司開發了一種新型長效重組蛋白或多肽藥物的技術平臺(WO?2005/047337)，其中公開了一種包含免疫球蛋白Fc片段作為載體的藥物組合物可以延長蛋白或多肽藥物的半衰期，并提高藥物的體內生物利用率。然而，如WO?2005/047337中所記載，其所得重組蛋白或多肽藥物最多僅保留約50％的體外細胞學活性。

本領域還需要在提高人內皮抑素的穩定性和體內半衰期的同時保留其生物活性，從而提高其生物利用度，減少治療劑量，并提高患者依從性的長效rhES制劑。

發明內容

本發明的目的是提供一種長效血管內皮抑素制劑，從而增強血管內皮抑素在體內的穩定性，提高其有效血藥濃度和生物利用度，并延長半衰期。本發明還提供了制備、分離和純化長效血管內皮抑素制劑的方法，以及所述長效血管內皮抑素制劑在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。