[發明專利]綠色木霉幾丁質酶基因Tvchi及其表達產物與應用

有效

• 申請號: 201110432620.9
• 申請日: 2011-12-21
• 公開（公告）號: CN102433351A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 楊麗榮;薛保國;全鑫;孫虎;梁慎;武超
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/63;C12N1/21;C12N15/11;A01N63/04;A01P3/00;C12R1/885
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體涉及一種綠色木霉幾丁質酶基因Tvchi?及其表達產物與應用。

背景技術

幾丁質酶(chitinase)是以幾丁質(chitin)為作用底物的水解酶。幾丁質又稱甲殼素或甲殼質,存在于節肢動物、線蟲和軟體動物的體壁、真菌細胞壁(除卵菌)和一些藻類等生物的細胞壁中。自1921年發現真細菌和放線菌在含有幾丁質的瓊脂上可形成透明圈，從而證明這些培養物內有水溶性的幾丁質酶存在以來，人們從未間斷對幾丁質酶的研究，多種微生物(細菌、放線菌、真菌)中分離和克隆了幾丁質酶，并對微生物源幾丁質酶的理化特性及生物學性狀進行了大量研究。幾丁質酶生產菌對真菌具有拮抗作用，在離體情況下也能抑制真菌的生長，且與其它細胞壁降解酶、植物病相關蛋白(PR)、殺菌劑、生防因子具有協同增效作用，因此幾丁質酶應用于生物防治受到人們廣泛的關注。

木霉菌(Trichodermaspp.)屬于半知菌類的常見土壤絲孢菌，廣泛存在于土壤、根圍、葉圍、種子和球莖等生態環境中，且可應用于植物病害生物防治。木霉菌能夠分泌產生細胞壁降解酶類，其中幾丁質酶尤為重要，而且不同種類的幾丁質酶表現出對作用底物和病原微生物拮抗活性的特異性。Lorito?研究表明，木霉幾丁質酶的生物防治效果要比植物、細菌和其他真菌的幾丁質酶好。最初從哈茨木霉菌株發現分子量分別為42、37、33kD的3種內切幾丁質酶。后來有學者確定了哈茨木霉P1菌株的5個幾丁質酶基因Chi18-2、Chi18-3、Chi18-4、Chi18-10和Chi18-13。其中ThEn42是第一個被克隆的幾丁質酶基因，該基因是目前進行遺傳和轉化研究的常用材料。?

發明人所在研究室從河南省不同小麥產區采集和分離獲得12株木霉分離物，經小麥全蝕（Gaeumannomyces?graminis?var.?tritici）、紋枯病（Rhizoctonia?cerealis?Vander?Hoeven）及赤霉病菌（Fusarium?graminearum）室內對峙實驗，篩選獲得1株對3種病原真菌均具有良好抑制效果的木霉ZBS-6菌株（菌種保藏號為CGMCC?No.3538，專利文獻號：CN102071145A），經形態分類學及ITS序列分析鑒定為綠色木霉（T.viride），已應用于田間小麥全蝕病防治試驗。但目前對木霉及其幾丁質酶基因的認識還很有限，現有一些幾丁質酶基因的表達產物的生物活性及表達量難以盡如人意，且利用原核表達木霉幾丁質酶活性較低；還有一些幾丁質酶（如綠木霉UKM-1菌株幾丁質酶等）對活性存在條件要求苛刻，制備、貯存成本高昂，這些因素制約著其在生物防治中的應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種具有SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列的綠色木霉幾丁質酶基因Tvchi，并構建了Tvchi原核表達載體，獲得了高抑菌活性的綠色木霉幾丁質酶。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

本發明以ZBS-6為研究對象，克隆和原核表達分析了幾丁質酶Tvchi基因，為木霉抗病基因及抗病機制的分子機理及作物病害生物防治提供了新思路。

一種綠色木霉幾丁質酶基因Tvchi，具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

一種由上述綠色木霉幾丁質酶基因Tvchi表達出的綠色木霉幾丁質酶。

所述的綠色木霉幾丁質酶，其特征在于，具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。

含有上述綠色木霉幾丁質酶基因Tvchi的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。

擴增上述綠色木霉幾丁質酶基因Tvchi全長或其任意片段的引物對。

所述綠色木霉幾丁質酶在降解幾丁質中的應用。

所述綠色木霉幾丁質酶在制備殺菌劑中的應用。

本發明具有積極有益的效果：

1.構建了Tvchi原核表達載體，成功的獲得了47kD左右的包涵體表達蛋白，通過咪唑洗脫、復性獲得了具有高活性的表達產物，其制備不需其它表達系統復雜過程，為后續活性檢測以及Tvchi功能域研究等提供了簡便的方法；