[發(fā)明專利]表達尼帕腦炎病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株

有效

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• 申請日: 2011-12-21
• 公開（公告）號: CN102559612A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設計）人: 步志高;溫志遠;葛金英
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;A61K39/155;A61P31/14;C12N15/85;C12R1/93
• 代理公司: 北京市漢信律師事務所 11373
• 代理人: 王文生

技術領域

本發(fā)明提供一種表達尼帕腦炎病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應用。具體而言，本發(fā)明提供表達尼帕腦炎病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVG(其保藏號為CGMCC?No.5402)及其在制備用于預防尼帕病腦炎的疫苗中的應用。

背景技術

尼帕病腦炎是一種高度烈性人畜共患傳染病，其病原尼帕病毒屬于副粘病毒科，亨尼帕病毒屬，同屬的只有亨德拉病毒[1]。尼帕病毒宿主范圍非常廣泛，其中豬是重要的易感動物。尼帕病毒的自然宿主為果蝠[2]。該病于1998年9月下旬至1999年6月中旬于馬來西亞首次爆發(fā)，發(fā)病例數(shù)高達265例，死亡105例，死亡率為385％。為了控制疾病的蔓延，馬來西亞政府屠殺了一百多萬頭豬，占該國養(yǎng)豬量40％。此后，該病又在印度、孟加拉等國陸續(xù)發(fā)生，而本病的致死率也呈現(xiàn)上升趨勢(67％-92％)[3]。尼帕病毒給這些國家的畜牧業(yè)發(fā)展和人民健康造成了嚴重危害。

我國目前雖然沒有該病爆發(fā)，但其已經對我國構成了巨大威脅。果蝠在東南亞地區(qū)廣泛分布，在我國南方地區(qū)分布較多，國內已有學者從我國南方地區(qū)的蝙蝠當中檢測到了尼帕病毒抗體的存在[4]。由于我國周邊多個國家爆發(fā)該病，伴隨著貿易往來的不斷加深該病傳入我國的壓力也不斷增大。且我國養(yǎng)豬數(shù)量極大，養(yǎng)豬業(yè)已成為我國農業(yè)的重要支柱性產業(yè)之一，因此該病一旦爆發(fā)勢必會對我國的養(yǎng)豬業(yè)及人民群眾的正常生活和生命安全造成嚴重危害，防控形勢不容樂觀。因此，儲備可以有效防控尼帕病毒的疫苗具有非常重要的戰(zhàn)略意義。

尼帕病毒G蛋白是一種位于病毒粒子表面的II型跨膜糖蛋白，其主要功能是介導病毒與細胞受體結合從而啟動病毒的感染過程。G蛋白是尼帕病毒的主要免疫保護性抗原，具有很好的免疫原性，是誘導機體產生中和抗體的主要結構蛋白。本研究以新城疫病毒LaSota弱毒株為載體，利用反向遺傳操作技術成功構建了表達尼帕病毒G蛋白的重組新城疫病毒活載體疫苗-rLa-NiVG，并在小鼠和豬體內對重組疫苗的免疫效果進行評價，實驗證明此疫苗可以產生誘導機體良好的體液免疫反應，是防控尼帕腦炎病毒的優(yōu)秀的候選疫苗，在我國應對尼帕病毒的潛在危害中顯示了良好的應用前景，具有重要的戰(zhàn)略意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供一種表達尼帕腦炎病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應用。具體而言，本發(fā)明提供表達尼帕腦炎病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVG(其保藏號為CGMCC?No.5402)及其在制備用于預防尼帕病腦炎的疫苗中的應用。

具體地，本發(fā)明成功構建了表達尼帕病毒(Nipah?virus，NiV)G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVG(該疫苗株于2011年10月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC)，并在小鼠和斷奶仔豬上系統(tǒng)評價了重組病毒產生的體液免疫反應。

本發(fā)明采用新城疫病毒LaSota弱毒株反向遺傳操作系統(tǒng)構建了表達尼帕病毒G蛋白的重組新城疫病毒rLa-NiVG。用間接免疫熒光和特異性細胞融合實驗證實尼帕病毒G蛋白的表達；將重組病毒免疫小鼠，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和水泡性口炎病毒囊膜嵌合尼帕腦炎病毒G/F蛋白偽型病毒粒子做中和試驗(VNA)以檢測重組病毒的體液免疫水平。結果顯示，rLa-NiVG能夠正確表達尼帕病毒G蛋白。將所述重組病毒免疫Balb/c小鼠，ELISA表明免疫組小鼠可產生較高水平的特異性IgG；病毒中和試驗顯示免疫小鼠可以產生針對尼帕病毒的中和抗體；豬免疫試驗表明，rLa-NiVG可以誘導豬產生高水平的尼帕病毒中和抗體。本研究成果目前國內外均無報道，具有很強的創(chuàng)新性。rLa-NiVG作為一種具有前瞻性，創(chuàng)新性，并且高效安全的防控尼帕病毒的候選疫苗，對我國應對尼帕病毒潛在威脅具有十分重要的戰(zhàn)略意義。

本發(fā)明提供制備表達尼帕病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟：

(1)構建重組轉錄質粒，該轉錄質粒包括其中插入尼帕病毒G基因的所述新城疫LaSota疫苗株的基因組cDNA序列，將所述重組轉錄質粒命名為pBRN-NiVG；

(2)構建轉錄輔助質粒系統(tǒng)，該輔助質粒系統(tǒng)包括編碼所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的輔助質粒pBSNP、編碼所述新城疫LaSota疫苗株的磷蛋白(P)的cDNA序列的輔助質粒pBSP、和編碼所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列的輔助質粒pBSL；