[發明專利]離子交換層析純化制備人輪狀病毒滅活疫苗的方法

有效

• 申請號: 201110431133.0
• 申請日: 2011-12-21
• 公開（公告）號: CN102552898A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 孫茂盛;李鴻鈞;吳晉元;楊星;易山;張光明
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: A61K39/15
• 分類號: A61K39/15;G01N33/569;C12N7/02;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 昆明科陽知識產權代理事務所 53111
• 代理人: 孫山明

1.離子交換層析純化制備人輪狀病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟：

（1）病毒液的制備和濃縮：

在Vero?細胞上進行病毒擴增，規模化培養45個轉瓶，細胞為致密單層時種毒，細胞密度為：1.33×10⁵個細胞/cm²×850cm²/轉瓶?=1.1×10⁸個細胞/轉瓶；當病毒增殖72h時收獲病毒，經反復凍融3次后，8000rpm離心20min?取上清液收獲得到9.8L含有病毒顆粒的病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL～700ug/mL,病毒感染性滴度為4.0lgCCID50?/mL以上；用截留分子量為100KDa的切向流超濾系統將9.8L病毒原液超濾濃縮36倍至0.27L,以備進入步驟（2）；

（2）病毒的純化：

（a）Q?Sepharose?Fast?Flow(簡稱QFF)離子交換層析純化

取20?ml病毒濃縮液以2ml/min?的流速加入預先用10mM、pH?7.60之PBS平衡好的裝有QFF填料的層析柱中，繼續用10mM、pH?7.60之PBS以2ml/min的流速過柱，直至在QFF離子交換層析圖譜OD280nm處無吸收峰出現后開始洗脫，洗脫采用1mol?/L?NaCl洗脫大于5倍柱體積時間，收集洗脫時OD280nm處吸收峰的樣品，其中，洗脫峰1為主要病毒抗原峰，收集后-80℃保存備用；

（b）純化洗脫峰的透析脫鹽

將步驟（a）的洗脫峰樣品裝入預先處理好的透析袋中，之后將透析袋置于裝有10mM、pH7.20之PBS的玻璃容器內，磁力攪拌器攪拌，透析袋旋轉速度為60～80次/min,?4℃透析24h，每8h更換一次玻璃容器內的緩沖液，經透析后的樣品為澄清溶液，pH?7.0～7.40；

（3）除菌過濾和滅活：

用0.22?μm?濾器過濾純化的病毒液，過濾后的病毒液按1:4000的比例加入福爾馬林，先置于56℃滅活半小時，之后置于37℃滅活72小時，雙抗體夾心ELISA檢測滅活后的純化輪狀病毒抗原含量和免疫原性，滅活后抗原量應不低于20480EU/ml。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征是檢測純化前后感染性滴度、抗原量及總蛋白去除率，包括：?

用熒光灶法測定病毒純化前后感染性滴度和抗原量如表1：

表1純化前后病毒樣品的感染性滴度和抗原量檢測結果

表1純化前后病毒樣品的感染性滴度和抗原量檢測結果（續前）

用Lowry法檢測病毒純化前后樣品蛋白含量及純化后病毒收獲液總蛋白去除率如表2：

表?2?經過Q?FF?離子交換層析純化后病毒收獲液的總蛋白去除率

。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征是檢測純化過程中病毒液的SDS-PAGE和?Western-blot：SDS-PAGE結果顯示，與超濾濃縮液相比，QFF純化目的峰樣品蛋白條帶數明顯減少，未見明顯雜蛋白條帶；相對應的Western-blot?結果顯示，蛋白條帶為輪狀病毒特異性蛋白條帶。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征是檢測病毒在純化過程中的基因組帶型電泳，結果顯示：病毒在純化過程中，基因組帶型未發生變異，帶型穩定。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征是檢測病毒在純化過程中的基因組帶型電泳，結果顯示：病毒在純化過程中，基因組帶型未發生變異，帶型穩定。