[發明專利]酶法檢測脂肪酶試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 201110430794.1
• 申請日: 2011-12-20
• 公開（公告）號: CN103173518A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 景晟;孫衛兵
• 申請（專利權）人: 上海復星醫藥（集團）股份有限公司;上海復星長征醫學科學有限公司
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王巍

技術領域

本發明涉及生物試劑，具體涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種酶法檢測脂肪酶試劑盒及其制備方法。

背景技術

脂肪酶(Lipase?EC3.1.1.3.，LPS，甘油酯水解酶)是一類水解油酯的酶類。脂肪酶的水解底物一般是天然油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相連接的酯鍵。它不同于其它水解酶，脂肪酶催化作用系統是一種非均相體系，水溶性的酶催化作用發生在水不溶性底物和水的界面上，這種界面上的催化作用機制不甚清楚，不能簡單用Michaelis2Menten學說解釋酶與底物間的反應機制。有人提出了脂肪酶在油-水界面上定位的假設，提出了“超底物”的模型，該模型能解釋脂肪酶的一些行為，但還需要進一步的實驗證明和修正。此外，脂肪酶兼具有逆向催化甘油和游離脂肪酸合成甘油脂活性。脂肪酶在臨床的意義：正常人血液LPS含量極少，但在急性胰腺炎時，2～12h血液LPS顯著升高，24h至峰值，可達正常值上限的10倍，甚至50倍，至48～72h可能恢復正常，但隨后又可持續升高8～15天。由于血液LPS在急性胰腺炎時活性升高的時間早，上升的幅度的大，持續的時間長，故其診斷價值優于淀粉酶。臨床觀察發現，凡血液AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高，約有2/3AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；非胰腺炎的急腹癥有血液AMY升高而LPS不升高。酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝膽疾患等血液LPS可有不同程度的升高。迄今測定LPS的方法可分為3類：①測定產物(游離脂肪酸)的增加(如滴定法、比色法、分光光度法、熒光法和pH電極法等)；②測定底物的減少量(如比濁法、擴散法等)；③測定LPS的實際質量(雙抗體夾心免疫分析法、乳膠凝集法)。目前在國內大多實驗室主要以滴定法、比濁法和分光光度法為主。分光光度法目前有兩類比較常用：①酶偶聯顯色比色法，多用1，2-甘油二酯為底物，在LPS和單酸甘油酯脂肪酶的催化下，水解生成甘油和脂肪酸，甘油通過甘油激酶作用生成3-磷酸甘油，再通過甘油磷酸氧化酶/過氧化物酶體系和4-AAP色素原體系產生紫紅色。于550nm波長連續監測吸光度的變化即可計算LPS活性。此類方法特異性高，通過雙試劑也基本可解決內源性甘油的干擾問題。②1，2-o-二月桂-外消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基試鹵靈)酯設計的連續監測法。該底物在堿性環境中，在LPS和輔脂肪酶作用下，水解生成1，2-O-二月桂基甘油和戊二酸-6’-甲基試鹵靈。后者不穩定，可自發分解生成戊二酸和甲基試鹵靈。甲基試鹵靈在581nm波長處有吸收峰，連續監測其吸光度變化可定量測定LPS活性。此法具有簡便、快速、靈敏、穩定和抗干擾能力強等特點。但是酶偶聯顯色法，工具酶的價格昂貴，而且酶來源少且不穩定，很少有廠家用這種方法。底物水解法，底物極不穩定，試劑的本底升高的極快，造成試劑要每天定標。浪費試劑也浪費校準品。而且會造成結果的不準確。因此亟待尋求更好的檢測方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，研究設計穩定脂肪酶的人工合成底物，提高試劑穩定性，用于檢測脂肪酶的試劑。

本發明提供了一種酶法檢測脂肪酶試劑盒，該試劑盒由下列試劑1和試劑2，按1份∶1份的比例組成：

試劑1：(2L)(試劑體積)

試劑2：(1L)(試劑體積)

去離子水加至總體積為1L。

所述試劑1緩沖液選自TRIS(三羥甲基氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane)、MOPS(3-(N-嗎啉)丙磺酸3-(N-morpholino)propanesulfonic?acid)、BICINE(N，N-雙(2-羥乙基甘氨酸)或HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic?acid)。

本發明檢測脂肪酶試劑盒，在使用時，試劑1加檢測樣本后再加入試劑2，即可進行檢測。

本發明的另一目的是提供了脂肪酶試劑盒的制備方法：該方法包括下列步驟：

(一)制備試劑1：(2L)(試劑體積)

(1)先向容器內加入為總量80％的去離子水；

(2)依次加入緩沖液、脫氧膽酸鈉、氯化鈣、疊氮鈉；

(3)加入輔脂肪酶；

(4)最后加入剩余量的去離子水至總體積為2L混合均勻，即得；

(二)制備試劑2：(1L)(試劑體積)