[發明專利]一種穩定和富集生物介質中兒茶酚胺的方法

無效

• 申請號: 201110430226.1
• 申請日: 2011-12-21
• 公開（公告）號: CN102553536A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 鄧慧華;喬婷;王爽;金晶;陸祖宏
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: B01J20/24
• 分類號: B01J20/24;B01J20/28;B01J20/30;B01D15/02;C07C215/46;C07C213/10
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發明屬于臨床醫學檢驗和臨床分析技術領域，具體來說，涉及一種穩定和富集生物介質中兒茶酚胺的方法。

背景技術

兒茶酚胺都是重要的單胺類神經遞質。兒茶酚胺含有鄰苯二酚基苯結構，又名鄰苯二酚胺，包括去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺，主要分布于交感神經細胞、腎上腺髓質和中樞神經系統。兒茶酚胺是細胞體內傳播神經沖動的重要遞質，具有重要的生理功能，與神經活動、行為以及大腦皮層的醒覺和睡眠節律都有關系。例如，腎上腺素是哺乳動物和人類中樞神經重要的信息傳遞物質，是由腎上腺髓質分泌的一種兒茶酚胺遞質。在生物體內，腎上腺素控制著神經系統進行一系列的神經化學過程及生物反應。在應激狀態、內臟神經刺激和低血糖等情況下，腎上腺髓質釋放腎上腺素進入血液循環，促進糖原分解并升高血糖，促進脂肪分解，引起心跳加快。腎上腺素代謝障礙會引起其含量變化，從而導致某些疾病的發生。因此，準確測定生物介質中的單胺類神經遞質含量，對基礎研究和臨床診斷都有重要的意義。

目前，離體檢測兒茶酚胺類神經遞質，常用三羥基吲哚法、乙二胺縮合法、熒光法、放射酶學法、高效液相色譜法、電分析化學法、毛細管電泳法、化學發光分析法和色質聯用法。檢測兒茶酚胺類神經遞質的生物介質一般為血液、唾液、尿液和羊水等。這些生物樣本中，兒茶酚胺類神經遞質的含量較低，一般在200-500pg/mL。另一方面，這些生物樣本中含有單胺氧化酶和氧位轉甲基酶，兒茶酚胺的胺基和兩個鄰位的酚羥基易被單胺氧化酶和氧位轉甲基酶降解。例如，尿樣中的兒茶酚胺被單胺氧化酶作用，去氨基后代謝為香草扁桃酸、高香草酸和3-甲氧基-4羥基苯乙二醇等。因此，在分析檢測前，常常對生物樣品進行預處理，去蛋白或加入蛋白阻隔劑。例如，常在血液中加入蛋白脲，以阻止兒茶酚胺以去氨基形式被代謝，其后再富集、提純、分離生物樣品中的兒茶酚胺。

兒茶酚胺的提取、分離常采用液液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)。液-液萃取又稱溶劑萃取或抽提。用溶劑分離和提取液體混合物中的組分的過程。在液體混合物中加入與其不相混溶(或稍相混溶)的選定的溶劑，利用其組分在溶劑中的不同溶解度而達到分離或提取目的。但液液分離存在特異性差及耗時多等缺點，在分離提純上也有缺點。固相萃取技術基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過程。SPE是利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理。較常用的方法是使液體樣品通過吸附劑，保留其中被測物質，再選用適當強度溶劑沖去雜質，然后用少量溶劑洗脫被測物質，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的。也可選擇性吸附干擾雜質，而讓被測物質流出；或同時吸附雜質和被測物質，再使用合適的溶劑選擇性洗脫被測物質。SPE裝置由SPE小柱(常用C18小柱)和輔件構成。提取、分離兒茶酚胺類物質通常使用C18小柱液固。例如，測定尿液和血液中柳丁氨醇，使用C18小柱提取后用高效液相色譜檢測。雖然SPE小柱有許多優點(如有機溶劑用量少、安全、高效等)，但在使用C18小柱洗脫時，SPE固相提純存在柱壓大、流速慢和時間長等缺點。這極可能導致不穩定、易降解的兒茶酚胺在分離提純過程中大量降解，并且影響最終的檢測結果。由于液液萃取法和固相萃取法存在上述技術缺點，導致兒茶酚胺在分離提純過程大量分解，故有效的富集方法對于兒茶酚胺含量的準確測量有著舉足輕重的作用。

發明內容

技術問題：本發明所要解決的技術問題是：提供一種穩定和富集生物介質中兒茶酚胺的方法，該方法采用磁性納米顆粒表面的磺化殼聚糖來穩定和富集生物介質中的兒茶酚胺，利用磁性納米顆粒的磁分離功能，從生物介質中分離和洗滌兒茶酚胺，過程簡單快速、成本低廉、富集率高。

技術方案：為解決上述技術問題，本發明穩定和富集生物介質中兒茶酚胺的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

10.制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括步驟101、102和103：

101.制備磁性納米顆粒，該步驟包括步驟1011、1012和1013：

1011.將摩爾比為2∶1的Fe³⁺和Fe²⁺投料：用濃度為2mol/L鹽酸溶液超聲攪拌溶解三氯化鐵，將鹽酸和三氯化鐵形成的混合溶液加入至反應釜中，通入氮氣攪拌，形成三氯化鐵鹽酸溶液；再用濃度為2mol/L的鹽酸溶液超聲溶解硫酸亞鐵，形成硫酸亞鐵鹽酸溶液；將硫酸亞鐵鹽酸溶液與三氯化鐵鹽酸溶液混合攪拌，形成混合鐵鹽溶液；