[發明專利]植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法

無效

• 申請號: 201110429891.9
• 申請日: 2011-12-21
• 公開（公告）號: CN102433357A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 王英娟;李立文;步懷宇;趙宇瑋
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司 61202
• 代理人: 謝鋼

1.一種使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）植物轉化受體的獲得；

（2）構建粘合蛋白基因Mefp-5基因的植物表達載體；

（3）采用農桿菌介導法將Mefp-5基因轉入煙草，獲得轉基因植株。

2.根據權利要求1所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于：步驟（1）中，使用煙草種子接種在MS?培養基得到無菌苗，無菌苗葉片切塊在MS分化培養基上分化不定芽，不定芽接種在MS生根培養基中生根，建立煙草離體再生體系，再生的煙草植株作為基因轉化受體。

3.根據權利要求2所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于：所述的MS分化培養基為MS?培養基+1.5mg/L?6-BA；MS生根培養基組成為MS?培養基+0.2mg/L?NAA。

4.根據權利要求1所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步驟（2）包括以下步驟：

（A）利用PCR方法克隆粘合蛋白基因Mefp-5，測序鑒定；

（B）粘合蛋白基因Mefp-5上游連接CaMV35S啟動子，下游連接NOS終止子后，形成的連接產物?CaMV35S-?Mefp-5-NOS插入載體pCAMBIA?1300的多克隆位點構建植物表達載體，命名為pMF；

（C）采用凍融法將pMF和命名為pMFck的對照pCAMBIA?1300導入農桿菌LBA4404中，用于植物的遺傳轉化。

5.根據權利要求1所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步驟（3）包括以下步驟：?

（A）煙草葉片切塊經農桿菌感染后，培養于MS篩選培養基中，誘導不定芽的分化；

（B）篩選培養基上進行抗性篩選培養40～50d，得到假定煙草轉基因小苗；

（C）對轉化煙草pMF、pMFck及其未轉基因的親本對照CK株系進行PCR、RT-PCR擴增，證明Mefp-5在煙草基因組DNA中的整合和表達，得到可表達粘合蛋白Mefp-5基因的轉基因煙草。

6.根據權利要求5所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于：所述的煙草葉片切塊為4周齡。

7.根據權利要求5所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于：所述的篩選培養基為MS分化培養基+?30mg/L潮霉素+?300mg/L頭孢霉素。

8.根據權利要求5所述使植物表達貽貝粘合蛋白Mefp-5的方法，其特征在于步驟（A）中農桿菌感染條件為：煙草外植體預培養2d，農桿菌濃度OD₆₀₀=0.6，浸染20min，不附加誘導劑乙酰丁香酮。