[發明專利]一種克服葡萄糖及乳酸抑制的透明質酸發酵方法

無效

• 申請號: 201110429599.7
• 申請日: 2011-12-20
• 公開（公告）號: CN102559801A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 羅瑞明;李亞蕾;楊波;劉曉連;余永紅
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12R1/46
• 代理公司: 寧夏專利服務中心 64100
• 代理人: 葉學軍

技術領域

本發明屬于微生物發酵技術領域，特別是一種克服葡萄糖及乳酸抑制的透明質酸發酵方法。

背景技術

透明質酸(Hyaluronic?Acid，簡稱HA)，又名玻璃酸，其分子量在幾十萬到幾百萬之間，由于結構上的特點，決定它具有比較特殊的物理化學性質，其水溶液有著良好的粘彈性和流變性，在食品，化妝和醫用方面都有應用。不同用途的HA對分子量有不同要求，小分子量的HA多用于保健品中，中等分子量的HA主要應用于化妝品，而高分子量的HA可用于眼科粘性手術、治療關節病、軟組織修復和作為藥物載體等，特別是在預防和減少外科手術后組織粘連中具有很高的應用價值。因此HA的生產中，高分子量和高產率依然是研究的主要目標。

近年來我國HA組織提取法研究已趨于成熟。但原料緊缺，工藝復雜，成本高，無法滿足國內市場需要。目前透明質酸已由傳統的動物器官提取法轉為微生物發酵法生產，微生物發酵法是制備HA的主要方法，國外對發酵法研究較早，技術也日見成熟，但因生產廠家少，世界需求仍然缺口大；近年來我國不少學者雖積極進行這方面的研究，但由于在菌種選育、發酵工藝和提取純化等方面的難題，使我國在這方面的研究進展緩慢。我國應加快發酵法生產透明質酸的步伐，關鍵是在提高產率，提高產品分子量和分離純化的技術方面進行攻關，趕上世界先進水平，以減少進口量。

在獸疫鏈球菌發酵過程中，透明質酸的產量在一定范圍內隨著底物濃度的增加而增加，若底物濃度過高，對透明質酸的生產有抑制作用，得到的透明質酸相對分子質量也較小。而且在產生HA的同時還會有乳酸生成，對菌體的生長和HA的產生都有抑制作用，在此發明中，針對發酵底物的不同和生成產物的多少，研究底物和產物對透明質酸生產的抑制作用，并指出解除抑制的方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種克服葡萄糖及乳酸抑制的透明質酸發酵方法。

為達到上述目的，本發明的方案為：

透明質酸的發酵工藝，以獸疫鏈球菌為種子，包括一級種培養，二級種培養及發酵培養，各過程培養基重量配方如下表：

所述一級種培養是從斜面試管轉種到錐形瓶中進行，培養溫度33℃～37℃，培養時間18～24小時；

所述二級種培養的步驟為：首先配制二級種子培養基，按照重量8％～12％的接種量接入一級種子進行培養，培養溫度33℃～37℃，培養時間20～24小時，OD₆₆₀值增加到0.8～1.2時接入發酵液中；

所述發酵培養的步驟為：首先配制發酵培養基，按照重量5％～10％的接種量接入二級種子進行培養，發酵溫度33℃～37℃，發酵周期30～35小時。

本發明的有益效果是：提高了透明質酸的產量，增大了透明質酸的分子量；解除底物和產物的抑制作用，本發明不僅可提高透明質酸的產量，而且得到的透明質酸的分子量大。

具體實施方式

本發明在具體實施時應注重以下技術要點：

1.制備的斜面必須適合菌體生長及其保存，不能太軟、太濕，或太硬，斜面出現干裂則不能使用。每代新斜面保藏于冰箱4℃，一般不應超過3～4周，時間過長，使活菌數減少，影響透明質酸產量。斜面的傳代數不應超過第六代，過多的傳代誘使菌種退化，應避免。

2.從斜面到二級種培養，斜面應在使用期內，轉移量要適當，不能太少，否則種子生長緩慢或不長，應保證二級種菌濃度OD₆₆₀在0.8左右。

3.從二級種培養到發酵培養，接種量為5％～10％(重量)，發酵期間攪拌的轉數不能過大，否則因剪切力過大使產物分子量下降。

4.(NH₄)₂SO₄配成20％(重量)的水溶液，葡萄糖配成50％(重量)的水溶液，另于112℃20min消毒后補加，葡萄糖和硫酸銨都為透明質酸合成提供必需的原料。

5.在發酵開始時主要是要求菌體的快速生長，再發酵生產透明質酸，所以要求初糖濃度較低，應分批補料方式加入葡萄糖，促進碳源轉化為HA。

6.發酵溫度過高，可加快菌體生長的速度，但不利于合成大分子的透明質酸。

7.發酵過程中，在菌體進入對數生長前期，pH的控制不宜高于8.0，而在對數生長中后期，pH不宜低于8.0，當加入硫酸銨、葡萄糖后，pH應在8.0～8.5間，直至發酵結束，pH在8.0～8.5時，有利于透明質酸生物合成。