[發(fā)明專利]快速檢測(cè)糞便中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110429558.8
• 申請(qǐng)日: 2011-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN102424839A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊學(xué)軍;田綠波;楊雨;陳肖瀟;石瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 樊學(xué)軍;田綠波;楊雨;陳肖瀟;石瑩
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/42;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞?wù)所 51124
• 代理人: 梁鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生化檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)糞便中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌的方法。

背景技術(shù)

沙門菌(Salmonella)是在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的常見人畜共患腸道病原菌，可引起食物中毒、胃腸炎、菌血癥、腸熱癥等疾病，因此世界衛(wèi)生組織(WHO)將沙門菌列入具有嚴(yán)重危害和中等危害的食物傳播性病原菌；志賀菌(Shigella)是引起人類細(xì)菌性痢疾的病原菌，分別為痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌和宋內(nèi)志賀菌，可引起食源性暴發(fā)，臨床表現(xiàn)通常為帶血腹瀉，主要流行于發(fā)展中國(guó)家，全世界每年發(fā)病數(shù)超過2億；大腸桿菌O157:H7(Escherichia?coli?O157:H7)是能引起人出血性腹瀉和腸炎的大腸桿菌，易繼發(fā)溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜并發(fā)癥，人群普遍易感，自美國(guó)1982年首次爆發(fā)流行以來，全球各地均有發(fā)生，1997年世界衛(wèi)生組織將大腸桿菌O157:H7病列為新的食源性疾病。這三種腸道病原菌在感染者的糞便中大量存在，也可能出現(xiàn)于健康攜帶者糞便中，易污染食品和水源，引起該類疾病的流行，因此，快速檢測(cè)糞便及其它樣品中這三種腸道病原菌，對(duì)預(yù)防和控制疾病發(fā)生和流行至關(guān)重要。但常規(guī)檢測(cè)這些致病菌需分離培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定等多個(gè)步驟，操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)(3～7天)，不利于衛(wèi)生檢疫、食品安全的檢測(cè)監(jiān)管，迫切需要開發(fā)快速、靈敏和特異的快速檢測(cè)技術(shù)，建立快速、敏感和多目標(biāo)的病原菌檢測(cè)工具。

國(guó)內(nèi)外針對(duì)快速檢測(cè)技術(shù)的研究，主要包括以下幾個(gè)方面：①檢測(cè)細(xì)菌某些專有的酶或產(chǎn)生的毒素的技術(shù)，②以檢測(cè)細(xì)菌生化反應(yīng)為基礎(chǔ)的細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)，③檢測(cè)細(xì)菌所特有的抗原的技術(shù)，通過抗原-抗體特異性反應(yīng)來檢測(cè)相應(yīng)的病原菌，例如：ELISA、膠體金技術(shù)等，④檢測(cè)細(xì)菌的核酸：如核酸雜交、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))、基因芯片、脈沖場(chǎng)電泳分型技術(shù)等。

雖然這些技術(shù)或系統(tǒng)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比，能夠在較短時(shí)間內(nèi)鑒定病原菌，但仍存在局限性：①這些技術(shù)和系統(tǒng)大多需要細(xì)菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，而得到細(xì)菌純培養(yǎng)物，一般要經(jīng)過非選擇性和/或選擇性增菌培養(yǎng)、平板分離、純培養(yǎng)這幾個(gè)步驟，需要1～4天時(shí)間，仍然不能充分滿足病原菌快速檢測(cè)的需要。②某些技術(shù)或系統(tǒng)成本高，如全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、脈沖場(chǎng)電泳儀、細(xì)菌檢測(cè)芯片系統(tǒng)等，雖然能夠較快速和多目標(biāo)檢測(cè)，但儀器設(shè)備和運(yùn)行費(fèi)用昂貴，不利于推廣，盡管已有研究致力于降低儀器設(shè)備和運(yùn)行費(fèi)用，如納米可視芯片的開發(fā)，但實(shí)驗(yàn)時(shí)間和反應(yīng)的信噪比有待進(jìn)一步改善。③缺乏能分離富集多種目的菌的樣品前處理技術(shù)。為此，要建立快速、敏感和多目標(biāo)的病原菌檢測(cè)平臺(tái)，必須解決樣品中病原菌的分離和富集以及同時(shí)檢測(cè)多目標(biāo)微生物這兩個(gè)問題。雖然已有多重PCR檢測(cè)果汁類樣品中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌O157:H7的報(bào)道，但與糞便樣品比較，果汁類樣品成分簡(jiǎn)單，其檢測(cè)體系難于適用于糞便樣品。

因此，本領(lǐng)域急需解決糞便樣品中沙門菌、志賀菌和大腸桿菌O157:H7難于快速檢測(cè)這一難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是本領(lǐng)域目前難于快速檢測(cè)解決糞便樣品中沙門菌、志賀菌或大腸桿菌O157:H7。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供一種用于檢測(cè)離體細(xì)菌中的上述細(xì)菌的多重PCR引物組及快速檢測(cè)方法。

本發(fā)明提供的檢測(cè)離體糞便中沙門菌和志賀菌的多重PCR引物組，包含以下引物對(duì)：

針對(duì)沙門菌invA基因的引物對(duì)：

上游引物5′-TATCGCCACGTTCGGGCAA-3′

下游引物5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′；

以及針對(duì)志賀菌ipaH基因的引物對(duì)：

上游引物5′-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3′

下游引物：5′-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3′。

進(jìn)一步的，上述多重PCR引物組還包括針對(duì)大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的的引物對(duì)：

上游引物5′-CACGAAAACGTGAAATTGCTGATATT-3′；

下游引物：5′-TCGATGAGTTTATCTGCAAGGTGATTC-3′。

本發(fā)明快速檢測(cè)離體糞便中沙門菌及志賀菌的方法包括以下步驟：

a、糞便樣本接種SS肉湯，37℃下進(jìn)行增菌培養(yǎng)8～24小時(shí)，分離獲取其中的細(xì)菌并提取其DNA模板；

b、將步驟a中獲得的DNA模板使用權(quán)利要求2中所述的多重PCR擴(kuò)增引物組進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；