[發明專利]雞新城疫診斷用抗原制備方法

有效

• 申請號: 201110428929.0
• 申請日: 2011-12-20
• 公開（公告）號: CN102565390A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 楚電峰;杜元釗;劉相娥;劉思思;徐慧琳;侯新華
• 申請（專利權）人: 青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 鄭明

技術領域

本發明涉及一種雞新城疫診斷用抗原制備方法，屬于獸用生物制品領域。

背景技術

新城疫是由新城疫病毒引起的一種禽類急性、熱性、敗血性傳染病，也是危害養禽業的最重要的疾病之一，該病常呈敗血癥經過，主要特征是呼吸困難，下痢，神經機能紊亂，粘膜和漿膜出血。其傳播速度快、死亡率高，危害嚴重，每年給世界養禽業造成巨大的經濟損失，因此被國際獸醫局(OIE)列為A類傳染病。通過快速、準確的方法鑒定本病，是預防和減少該病危害的有效措施(蔡寶祥，殷震，謝三星等.動物傳染病診斷學.南京：江蘇科學技術出版社，1993，177～180.)。也有部分學者從事新城疫抗原研究，但均不具體，也沒有解決新城設診斷抗原制備工藝的關鍵控制點，本發明人主要解決了該診斷抗原的實質性關鍵問題，且實解決了新城疫抗原只停留在研究階段，從根本上將該工藝應用于生產檢驗的實踐中，為雞場新城疫的感染與早期診斷預防提供很好的診斷、鑒別用抗原。

發明內容

本發明的目的是制備出適用于雞新城疫診斷用抗原，為雞場早期診斷和預防雞新城疫，減少經濟損失，提供優良的診斷制品。本發明采用免疫原性好、效價高，穩定、毒力弱的新城疫病毒IV系La?Sota株病毒作為抗原制備用種毒，經適宜條件培養后，收獲培養物，經甲醛溶液滅活，超濾濃縮后，輔以相應凍干保護劑，經冷凍干燥后制成。用于診斷和早期預防雞新城疫。

一、制備診斷抗原用毒株

1.毒株來源

制備診斷抗原的病毒為新城疫病毒(Newcastle?disease?virus)LaSota-C8株病毒，該病毒已于2011年12月13日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCCNo.5576。該新城疫病毒CGMCC?No.5576株來自目前世界公認的雞新城疫診斷抗原的制備與預防用疫苗生產的經典毒株新城疫病毒CVCC?AV1615毒株；對CVCC?AV1615毒株經系統克隆、篩選、純化等工藝，優選出病毒血凝(HA)效價高、病毒含量(EID₅₀)高的克隆株病毒，該毒株最大程度的提高了種毒的效價保持原新城疫病毒CVCCAV1615毒株遺傳穩定、毒力弱、不返強等特點，安全性能良好等特點。

2.毒株特點

(1)培養特性??本病毒株適宜在在9～10日齡的雞胚上培養，溫度為36.5℃、濕度為55％～60％，培養特性良好，繁殖性能高，且遺傳穩定性好。

(2)效價??病毒血凝(HA)效價高達到2¹¹、病毒含量(EID₅₀)高達到10^9.3～10^9.7/0.1ml。

(3)菌株毒力??毒力弱，本病毒株適宜用于雞新城疫活疫苗與滅活疫苗生產之用，對各日齡雞均較安全，毒力不返強，且傳代穩定性良好。

二、本診斷抗原的制備與檢驗：

1.抗原制備

(1)病毒種毒??該抗原是用雞毒株為新城疫病毒La?Sota-C8株作為抗原生產毒株的；

(2)種蛋??選用美國Merial公司9～10日齡的SPF雞胚進行培養，要求種蛋大小均勻、表面清潔、受精率高、孵化率高、純凈無任何外源病毒或細菌污染；

(3)孵化??先對孵化器進行甲醛熏蒸消毒。溫度：一般在37.5℃～38℃之間。濕度：立體孵化器的最適宜孵化濕度75％；通風換氣：隨著雞胚的發育，產生的熱量增多，同時對氧氣的需要量也逐漸增大，要保持孵化器內空氣新鮮，風扇轉速一般為60～180r/min；

(4)收獲??接種種毒后的雞胚，后孵化要求溫度36.5℃、濕度55％～60％，培養96～120小時；逐個無菌收獲雞胚尿囊液，混合均勻后成為制備抗原的病毒液；

(5)滅活??按病毒液體積的1‰體積(V/V)加入福爾馬林溶液，置于100～120r/min搖床上搖晃，于2℃～8℃滅活間48小時；

(6)濃縮工藝??采用美國Millipore高密度濃縮機對抗原用病毒液進行濃縮，去除大分子雜蛋白、尿酸鹽等外源雜質干擾，提高病毒液的純度和效價；

(7)凍干??采用明膠蔗糖保護劑，經高壓滅菌后與滅活后的病毒液按1∶1的比例混合均勻，等量分裝后凍干。

2.抗原檢驗