[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)延胡索酸米根霉及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110428735.0
• 申請日: 2011-12-20
• 公開（公告）號: CN102559518A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設計）人: 陳堅;周正雄;周景文;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/60;C12N15/63;C12P7/46;C12R1/845
• 代理公司: 北京匯信合知識產(chǎn)權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

1.一種高產(chǎn)延胡索酸米根霉(Rhizopus?delemar)，其特征在于過量表達釀酒酵母丙酮酸羧化酶基因。

2.根據(jù)權利要求1所述米根霉的構建方法，其特征在于包括如下步驟：

1)根據(jù)米根霉(R.delemar)胞內(nèi)蛋白的表達與啟動子直接相關，而與拷貝數(shù)無關，以NCBI公布的Rhizopus?oryzae?AF282846、AF282847序列設計兩對引物分別擴增丙酮酸脫羧酶基因的啟動子與終止子片段；

2)以NCBI公布的NM_001180927.1序列，采用化學全合成方法合成丙酮酸羧化酶基因編碼區(qū)；

3)將步驟1)和2)得到的三段片段進行融合，形成完整的丙酮酸羧化酶基因表達框；

4)將步驟3)獲得的表達框克隆到pRS303H載體，轉(zhuǎn)化米根霉懸浮孢子后得到重組菌。

3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征是所述轉(zhuǎn)化在1000V～10000V的電場強度下進行。

4.權利要求1所述米根霉應用于延胡索酸的生產(chǎn)，其特征在于采用所述米根霉為出發(fā)菌株，接種到產(chǎn)孢子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)5-7天，至分生孢子成熟；無菌水洗下孢子，稀釋到106個/mL；以4％的體積比轉(zhuǎn)接孢子懸浮液至種子培養(yǎng)基，30℃，200rpm培養(yǎng)30h；以10％的體積比轉(zhuǎn)接前培養(yǎng)種子至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200rpm培養(yǎng)72h。

5.根據(jù)權利要求書4所述的應用，其特征是種子培養(yǎng)基成分為(g/L)：葡萄糖20，大豆蛋白胨6，碳酸鈣6。

6.根據(jù)權利要求4或5所述的應用，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L)：葡萄糖80，(NH4)2SO4?2，KH2PO4?0.3，MgSO4?7H20?0.4，ZnSO4?7H2O?0.044，F(xiàn)eSO4?7H2O?0.01，CaCO3?80，滅菌后加甲醇15mL。

7.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征是所述米根霉在葡萄糖為唯一碳源，培養(yǎng)72h，延胡索酸產(chǎn)量達到55.92g/L。