[發明專利]一種禾谷鐮刀菌的分子檢測方法及應用

無效

• 申請號: 201110428400.9
• 申請日: 2011-12-19
• 公開（公告）號: CN102382899A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 張旭;馬鴻翔;周永進;陳健華;余桂紅;孫曉波;王磊
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

一.技術領域

本發明屬于作物病害診斷及防治技術領域，具體涉及一種禾谷鐮刀菌的分子檢測方法及應用。

二.背景技術

由鐮刀菌(Fusarium?spp.)(Fusarium?head?blight，FHB)引起的小麥赤霉病是一種廣泛流行的世界性病害，主要發生于溫暖濕潤地區，是影響小麥高產、穩產和優質的重要因素之一。20世紀90年代以來，北美、歐洲、亞洲等地大麥、小麥赤霉病災情嚴重。我國南方長江中下游冬麥區發生嚴重，隨著全球性氣候變暖、耕作制度以及耕作方式的改變，小麥赤霉病正向黃淮麥區、北方麥區以及西南和西北麥區擴展(Ma等，2008)，幾乎蔓延到所有小麥種植區。2003年，長江中下游地區60-80％的麥區感染赤霉病，減產超過20％。2005年，江蘇省赤霉病的發生面積為1800萬畝左右，占全省總種植面積的72％。2011年，全國農業技術推廣服務中心預報全國赤霉病流行面積為6500萬畝。

小麥赤霉病的發生與流行還帶來巨大的食品安全性隱患。鐮刀菌可以產生單端孢霉烯毒素(trichothecene)，人畜食用受赤霉病真菌毒素污染的面粉會發生嘔吐、腹瀉及食欲不振等急、慢性中毒癥狀，嚴重者可導致死亡(陸維忠等，2001)。據美國估計，因此類毒素污染所造成的直接經濟損失僅199l～1996年間就高達三億美元。我國、歐盟和美國、加拿大均要求面粉、面包、餅干等食品中DON毒素的限量標準為1000μg/kg(1ppm)(Buerstmayr等，2009；GB?16329-1996)。因此，明確我國小麥赤霉病致病菌的種類與產毒類型，對開展小麥赤霉病防治與抗病育種都有重要的實踐意義。

自20世紀40年代中國首次報道小麥赤霉病以來，國內外研究認為，禾谷鐮刀菌(Fusarium?graminearum?Schwabe)是小麥赤霉病的主要致病菌之一，也是中國小麥赤霉病的優勢致病菌。近年來的研究表明，F.?graminearum是一個含有許多特定種系的復合種(Fg?Complex)，O’Donnell等(2004，2007)通過系統發生學分析，將Fg?Complex劃分成13個特定的正式命名的種。根據該項研究結果，目前中國小麥赤霉病的致病菌，主要為禾谷鐮刀菌(F.graminearum)和亞細亞鐮刀菌(F.asiaticum)，其中北方麥區如西北麥區和東北麥區，年平均溫度低于15℃時，麥區赤霉病的優勢致病菌為禾谷鐮刀菌(Qu等，2008)。因此，快速、準確鑒定檢測禾谷鐮刀菌，有利于對北方麥區小麥赤霉病的防治。

傳統的鐮刀菌鑒定方法主要通過形態學，如大分子生孢子、小分生孢子、原膜孢子等的形態來鑒定。但形態學鑒定方法繁瑣，沒有統一的規范標準，并且需要豐富的實踐經驗。隨著遺傳與分子生物學技術的迅速發展，分子標記也成為鑒定鐮刀菌的主要技術手段。與常規的形態鑒定法相比，分子標記能準確、快速地從混合群體中鑒定出不同病菌類型，為準確、快速分析病菌的群體分布、特點和鑒定診斷提供新方法。

Nicholson等(1998)找到了一對鑒定禾谷鐮刀菌的標記Fg16F/R，但在擴增來自不同地區的禾谷鐮刀菌株時得到6種PCR產物，不能有效地區分菌株的種類。Qu等(2008)利用該對引物，并結合AFLP標記，鑒定出Fg16F/R擴增產物為類型1和AFLP擴增產物為類型A的菌株為禾谷鐮刀菌。由于AFLP標記操作繁瑣，且涉及到酶切和兩次PCR擴增等步驟，難以在實際檢測中推廣應用。Yang等(2008)利用氨連接酶基因的單核苷酸多態性(SNP)設計了4個引物試圖來區分Fgcomplex中的七個種，其中鑒定禾谷鐮刀菌需要擴增出536bp和311bp等2條不同大小的條帶，并且還需要通過條帶的強弱進行輔助判斷，并不能真正滿足快速簡易檢測的要求。

三.發明內容

本發明需要解決的問題是：提供有效而容易獲得的方法鑒定禾谷鐮刀菌，使之可以直接從麥穗、種子、飼料中快速、靈敏、準確檢測出赤霉病致病菌禾谷鐮刀菌。

本發明的技術方案為：1.設計禾谷鐮刀菌檢測的特殊引物。2.禾谷鐮刀菌檢測體系的建立。

1.設計禾谷鐮刀菌檢測的特殊引物。

根據禾谷鐮刀菌DNA序列的特性，設計了對禾谷鐮刀菌具有特異擴增作用的一對引物：引物15′-GAGTCCAAACCGGATACGTCACGCT-3′和引物25′-TGCGTACGAATTGCAGAAGATGTCC-3′。

2.禾谷鐮刀菌檢測體系的建立。

a)提取病原菌基因組DNA；