[發明專利]減低蛇毒神經生長因子免疫毒性使之成為鼠源神經生長因子的藥物替代品的方法

有效

• 申請號: 201110428037.0
• 申請日: 2011-12-19
• 公開（公告）號: CN103159844A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 江濤;唐捷;童瓊;周洪哲;孫含麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;C07K1/18;C07K1/16;A61K38/18;A61P25/00
• 代理公司: 北京市漢信律師事務所 11373
• 代理人: 王文生

發明領域：

本發明通過結構生物學和生物化學研究發現來自眼鏡蛇的神經生長因子(cNGF)特異結合脂類小分子，這些脂類小分子是其免疫毒性的主要來源之一。因此，本發明提供一種眼鏡蛇毒神經生長因子(cNGF)的純化方法和脫脂方法，利用有機溶劑采取特殊工藝對純化的cNGF進行脫脂處理，成功地去除了脂類小分子，并通過細胞實驗證實脫脂后的cNGF減少了對小鼠肥大細胞瘤細胞的免疫毒性，可作為鼠源神經生長因子的替代藥物作為低副作用具有神經營養作用的藥物。

背景技術：

神經生長因子(NGF)在人體中廣泛分布，是一個有著復雜功能的生物活性蛋白。成熟的有生物活性的NGF以同源二聚體的形式存在于生物體中，其單體是含有120個氨基酸的多肽，分子量約為13kD。兩個單體的折疊片以廣泛的疏水作用形成穩定非共價的活性雙體形式。

NGF在人體中廣泛分布，除了神經系統和結構性細胞中可以找到NGF的蹤跡，在免疫系統的炎癥細胞中也能表達NGF，它們是：肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞、B細胞和T細胞等。NGF可以在特定的部位和組織高豐度表達，而這些部位和組織就是天然提取NGF的最佳來源。已知的有(1)雄性成年小鼠頜下腺；(2)牛精漿；(3)蛇毒；(4)豚鼠前列腺。其中小鼠頜下腺和蛇毒中的含量最為豐富，都以毫克級存在，是兩個最主要的來源。雖然蛇源和鼠源神經生長因子的神經營養作用相似，但它們的免疫學行為卻有很大差異。

NGF具有神經元營養和促進突起生長雙重生物學功能，對種屬和周圍神經元的生長、發育、分化、正常狀態的維持、凋亡、損傷后的保護和軸突的有效再生都有著重要作用。隨著大量深入研究，在神經細胞、炎癥細胞和結構細胞中都可以表達NGF和NGF受體，說明這些細胞不僅可以分泌NGF也是NGF的靶細胞，受到NGF的調控，并且暗示著NGF可能是這些細胞之間的樞紐。研究表明，NGF在神經系統以外表現出非常活躍的生物學功能，例如許多免疫細胞上都存在NGF受體，NGF能增強特異性和非特異性免疫反應，通過影響免疫細胞的活性，進而調節免疫系統功能，在免疫系統炎癥疾病中扮演了非常重要的角色，如哮喘、肺炎、關節炎。在臨床上，NGF已經應用于治療多種疾病，如外傷引起的神經損傷、視神經病變、角膜潰瘍、耳聾耳鳴，骨病中促進軸突定向再生、髓鞘生成，帕金森病、阿爾茲海默癥、多發性神經炎、帶狀皰疹和面部神經麻痹等等。

NGF是神經系統中最重要的生物活性分子之一。NGF不僅對神經系統有作用，而且對于免疫系統、造血系統也有一定的影響。目前我國已有鼠源和人源NGF新藥用于臨床，是有效的治療神經系統疾病和退行性神經病變的新型生物制劑，適用于神經內科、神經外科和創傷等病癥。由于小鼠NGF與人的NGF有很高的同源性(89％)，并且材料的來源豐富，因此，目前藥效較好的天然NGF多是以小鼠頜下腺為原料提取的。

目前為止，NGF的晶體結構有6個，但是卻沒有一個是蛇源的NGF蛋白，有4個是鼠源的，另外2個則是人源的NGF在大腸桿菌中重組表達的。蛇源cNGF與鼠源mNGF的氨基酸序列比對表明，兩者的同源度約為63％。小鼠頜下腺和蛇毒兩種來源的NGF生物活性相似，但蛇毒NGF具有耐酸、耐堿、耐蛋白酶水解和穩定性高的特點，且來源豐富，說明蛇毒NGF具有更廣闊的應用前景。目前為止，也已經有以舟山眼鏡蛇毒NGF為原料的藥品上市，但是因為毒副作用比較大，并且其副作用機理不清楚，限制了其應用。

人們研究神經生長因子NGF半個多世紀以來，已經找到了它的兩個膜上受體，并且對于分別與這兩個受體相關的信號通路的研究也比較透徹。在這些研究中經常可以注意到一些脂類分子的存在，這些脂類分子或是與其受體偶聯的信號通路相關，或是與調節NGF的受體表達水平相關，或是被NGF調節等等。長久以來，科學家們都是在NGF周邊間接地研究這些脂分子與NGF相關的生物功能，也很少有學者直接的將NGF與脂分子聯系起來。例如，從蛇毒和大鼠頜下腺中提取的NGF與lysoPS共同作用可以誘導肥大細胞的脫顆粒反應，釋放出多種炎癥介質：如5-羥色胺(5-HT)、組胺(hiatamine)和白介素等，但是其機理至今仍然不清楚。

脂類是一類低溶于水卻易溶于非極性溶劑的生物有機分子。脂類是富含能量的營養素，是生物體中能量的一種儲存形式，脂類也是組成生物膜的重要組分，為保持膜的完整性和流動性提供支持。脂類還做為一些物質的前體形式存在。近年來研究表明脂類也參與了細胞信號傳導，有一些非常重要的脂類被定義為第二信使，發揮傳遞信號的中介功能，調控生命活動。

發明內容：