[發(fā)明專利]一種評(píng)價(jià)膳食鐵生物有效性的改良模型及其建立方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110427981.4
• 申請(qǐng)日: 2011-12-19
• 公開（公告）號(hào): CN102676370A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何萬領(lǐng);李曉麗;王占彬;李元曉;張才;李旺;曹平華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12M1/00
• 分類號(hào): C12M1/00;C12Q1/02;G01N33/68;G01N27/62
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種適應(yīng)于谷物籽粒、鐵強(qiáng)化劑和動(dòng)物性食物中鐵生物有效性的評(píng)價(jià)的模型，同時(shí)還涉及該模型的建立方法。

背景技術(shù)

鐵缺乏是當(dāng)今世界性微量元素營(yíng)養(yǎng)饑餓問題，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)表明，全世界超過35億人缺鐵，尤其是青少年、孕產(chǎn)婦、老年人和嬰幼兒，缺鐵性貧血多達(dá)14.8億。缺鐵已嚴(yán)重影響世界人民的身體健康、智力發(fā)育和工作能力。消滅人類鐵營(yíng)養(yǎng)饑餓已成為世界各國(guó)急需要攻克的難題之一。膳食多樣性、食品鐵強(qiáng)化、補(bǔ)充鐵強(qiáng)化劑是解決人體鐵缺乏的重要途徑，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體鐵營(yíng)養(yǎng)狀況與膳食中鐵含量間并沒有密切相關(guān)。這一結(jié)果表明，無論是在選擇富鐵食物時(shí)，還是選擇鐵強(qiáng)化劑時(shí)必須考慮鐵的生物有效性，而非鐵含量的多少。由于涉及倫理道德和人體生命安全，采用人體實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)膳食中鐵生物有效性受到了限制。近年來，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和相關(guān)生物技術(shù)的發(fā)展，使得用細(xì)胞模型評(píng)價(jià)鐵對(duì)人體的生物有效性提供了保障。1996年美國(guó)康奈爾大學(xué)的Glahn教授首次建立了Caco-2細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)化模型，用于評(píng)價(jià)鐵的生物有效性，從而掀開了用Caco-2細(xì)胞模型模擬人體腸道進(jìn)行微量元素鐵吸收研究的序幕。Caco-2細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)化模型是以細(xì)胞鐵蛋白合成量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的，而細(xì)胞合成鐵蛋白的量是有限度的，當(dāng)被測(cè)食物樣品實(shí)際鐵生物有效性高于細(xì)胞鐵蛋白合成的速率時(shí)，評(píng)價(jià)結(jié)果就會(huì)偏低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種鐵生物有效性評(píng)價(jià)更加準(zhǔn)確、全面地模擬鐵在人體的吸收利用過程的評(píng)價(jià)膳食鐵生物有效性的改良模型。

同時(shí)，本發(fā)明的目的還在于采用了一種該評(píng)價(jià)膳食鐵生物有效性的改良模型的建立方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種評(píng)價(jià)膳食鐵生物有效性的改良模型，包括模型結(jié)構(gòu)，細(xì)胞種類和評(píng)價(jià)指標(biāo)，所述的模型結(jié)構(gòu)中設(shè)置有插入槽，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)位置設(shè)置在插入槽底膜上，模型結(jié)構(gòu)具備頂側(cè)室(腸腔側(cè))和基底側(cè)室(血漿側(cè))。

所述的細(xì)胞種類包括Caco-2細(xì)胞，內(nèi)臟上皮細(xì)胞，內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)板的基底側(cè)。

所述的內(nèi)臟上皮細(xì)胞為原代培養(yǎng)的和繼代培養(yǎng)的肝臟、腎臟上皮樣生長(zhǎng)的細(xì)胞。

所述的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括鐵蛋白合成量，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)鐵量和內(nèi)臟上皮細(xì)胞鐵含量。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種該評(píng)價(jià)膳食鐵生物有效性的改良模型的建立方法，包括以下步驟：

(1)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)；

(2)內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)；

(3)模型建立當(dāng)步驟(1)和步驟(2)的細(xì)胞均達(dá)到試驗(yàn)要求后，將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有內(nèi)臟上皮細(xì)胞的六孔板中，聯(lián)合培養(yǎng)22-26h；

(4)鐵生物有效性試驗(yàn)

將被評(píng)價(jià)食物樣品采用傳統(tǒng)的消化系統(tǒng)進(jìn)行模擬消化，離心，獲取上清液，將上清液與HBSS緩沖液混合制成鐵吸收試驗(yàn)液，同時(shí)做不含鐵的對(duì)照組試驗(yàn)液；吸取1.5mL鐵吸收試驗(yàn)液滴入聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)在內(nèi)臟上皮細(xì)胞層加入等滲的HBSS孵育液，于37℃，55轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)器中孵育2h。

(5)指標(biāo)測(cè)定

分別收取Caco-2細(xì)胞、內(nèi)臟上皮細(xì)胞、基底側(cè)孵育液，用鐵蛋白試劑盒測(cè)定Caco-2細(xì)胞鐵蛋白合成量；用ICP-MS技術(shù)檢測(cè)內(nèi)臟上皮細(xì)胞內(nèi)鐵含量和基底側(cè)孵育液中鐵含量。

用內(nèi)臟上皮細(xì)胞鐵含量評(píng)價(jià)鐵在內(nèi)臟器官中的蓄積量；用內(nèi)臟上皮細(xì)胞鐵含量與基底側(cè)孵育液中鐵含量之和評(píng)價(jià)腸道向體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量；用Caco-2細(xì)胞鐵蛋白合成量、內(nèi)臟上皮細(xì)胞鐵含量、基底側(cè)孵育液中鐵含量聯(lián)合評(píng)價(jià)膳食鐵對(duì)人體的總生物有效性。

步驟(1)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)為：將插入槽放入六孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞密度為3×10⁵的Caco-2細(xì)胞混合液1.5mL滴入插入槽的底膜上，同時(shí)，在基底側(cè)加入2mL含胎牛血清10％的DMEM培養(yǎng)液。

步驟(2)內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)為將內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)于另一塊六孔板的基底側(cè)，并根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特性，考慮與Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行調(diào)整(可適當(dāng)提前、延后或同時(shí)培養(yǎng))，若選用原代細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)以原代細(xì)胞培養(yǎng)為主，當(dāng)原代細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后，再結(jié)合Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)。