[發明專利]耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法

無效

• 申請號: 201110427711.3
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102432682A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 李建科;夏凱
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C07K16/06;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 申忠才

技術領域

本發明涉及食品微生物檢測領域，具體涉及到耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備及純化鑒定。

背景技術

耐熱菌，學名酸土環脂芽孢桿菌(Aliyclobacillua?acidoterrestris)，是果汁生產中的常見危害菌，由于其耐熱耐酸特性，能夠經受酸性果汁加工中的巴氏殺菌過程而存活，在產品貯藏期，當處于休眠狀態的芽孢在適宜溫度條件下，就會迅速增殖引起果汁敗壞，嚴重影響果汁的質量安全。因此，耐熱菌是濃縮果汁生產中最重要的目標控制微生物之一。關于果汁中耐熱菌的檢測，目前主要分為以下三類：傳統的平板培養計數法、基于遺傳物質檢測的PCR法和基于免疫學的快速檢測方法。目前，生產企業多采用傳統平板培養計數法檢測耐熱菌，平板培養計數法最大的缺點是耗時長，一般檢測周期為4～5天。PCR法具有快速、特異的優點，但對設備、實驗室條件以及操作人員要求高，步驟較繁鎖，推廣應用有一定困難。基于免疫分析原理的酶聯免疫快速檢測技術，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、檢測設備及實驗條件易達到等優點，而建立該檢測方法的關鍵在于獲得高效價、高特異性的抗體。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種操作簡便、特異性強、成本低廉的耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案是它由下述步驟組成：

1、制備耐熱菌菌懸液

將耐熱菌標準菌株(A.acidoterrestris?DSM?3922)轉接至250mL的402培養基，置于45℃氣浴中振蕩培養8小時，轉接至凱氏培養基，41℃培養24小時，用無菌生理鹽水沖洗凱氏培養基上培養的耐熱菌，將沖洗下的耐熱菌移至無菌三角錐瓶中充分混勻，3500～5000轉/分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用生理鹽水洗滌3次，向沉淀中加入無菌生理鹽水，稀釋成濃度為1.4×10⁸～4×10⁹CFU/mL的耐熱菌菌懸液。

2、耐熱菌免疫SD大鼠

將步驟1中制備的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為0.5～1.5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，免疫63～91天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。

3、飽和硫酸銨沉淀法分離抗體

向步驟2制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗血清中加入無菌生理鹽水，逐滴加入pH值為8.0的飽和硫酸銨水溶液，耐熱菌的鼠源多克隆抗血清與無菌生理鹽水、飽和硫酸銨水溶液的體積比為1∶1∶2，充分搖勻，4℃靜置12小時，12000～20000轉/分鐘離心20分鐘，棄去上清液，所得沉淀用生理鹽水溶解，裝入透析袋中透析除鹽。

4、G蛋白親和層析純化抗體

向透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體中加入0.1mol/L?pH值為9.0的Tris-HCl緩沖液，調節耐熱菌的鼠源多克隆抗體的pH值至8.0，用G蛋白親和層析柱分離，上樣量與柱體積之比為2∶1，流速為1mL/分鐘，上樣完成后用0.1mol/L?pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白至基線穩定，用0.1mol/L?pH值為3.0的檸檬酸緩沖液洗脫結合的耐熱菌的鼠源多克隆抗體，分別收集雜蛋白和耐熱菌的鼠源多克隆抗體，收集的耐熱菌的鼠源多克隆抗體裝入透析袋中透析除檸檬酸根離子，透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體用平均分子量為6000的聚乙二醇濃縮至與上樣量體積相同。

本發明的耐熱菌免疫SD大鼠步驟2中，優選將步驟1中制備的濃度為2×10⁹CFU/mL的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，注射體積為1mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行4次追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，免疫63天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。

本發明制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗體效價可達到12800，特異性良好，與常見食源性微生物無交叉反應，經電泳鑒定有較高純度。本發明方法簡單，成本低，可用于建立耐熱菌免疫化學檢測方法。

附圖說明

圖1是純化前后耐熱菌鼠源多克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖譜。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。

實施例1

1、制備耐熱菌菌懸液