[發(fā)明專利]一種魚類廣譜弧菌亞單位疫苗及制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110427085.8
• 申請日: 2011-12-20
• 公開（公告）號: CN102512674A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設計）人: 林海英;鄭磊;郭養(yǎng)浩;唐鳳翔;石賢愛;鄭允權(quán)
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K39/106;A61K9/16;A61K9/08;A61K47/32;A61P31/04;C12N15/70;C07K19/00;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于：所述疫苗以副溶血弧菌外膜蛋白OmpK和鞭毛蛋白FlaA的融合蛋白FlaA-OmpK作為抗原成分。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于，抗原成分為FlaA和OmpK通過連接肽G1y₄Ser相連成重組融合蛋白FlaA-OmpK；重組融合蛋白FlaA-OmpK的氨基酸序列如SEQ.NO.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于，該疫苗用于防治副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌對魚類的感染。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于：所述疫苗的類型為腹腔注射疫苗或口服腸溶微球疫苗，免疫方式為腹腔注射免疫或口服免疫。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于：腹腔注射免疫時,?疫苗為重組融合蛋白FlaA-OmpK的生理鹽水溶液,免疫劑量為80-100μg/次，按100g體重計；口服免疫時,?將口服腸溶微球疫苗摻合餌料中,?自然攝食,免疫劑量為80-200μg/天，按100g體重計,?連續(xù)2-4天口服免疫。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于：所述口服腸溶微球疫苗，采用丙烯酸樹脂包裹融合蛋白FlaA-OmpK，使其具有腸溶功能，同時所制備的口服疫苗為微球狀，粒徑10－50nm。

7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于：所述口服腸溶微球疫苗的制備方法，包括如下步驟：

(1)?融合蛋白FlaA-OmpK?100mg溶于20mL?TE-buffer中，10-30g丙烯酸樹脂Ⅱ號溶于250mL乙醇中?,這兩種溶液在攪拌條件下混合均勻，作為內(nèi)油相；

(2)內(nèi)油相在10000r/min攪拌條件下緩慢加入1000mL液體石蠟，所述液體石蠟含0.1-1.0mL卵磷脂和0.1-0.6%?Span80，乳化30min后，改為常規(guī)攪拌600r/min，持續(xù)攪拌至乙醇完全揮發(fā)，微球固化；

(3)離心收集微球顆粒，用乙醇洗滌數(shù)次，60℃干燥4h，即得口服腸溶微球疫苗。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的魚類廣譜弧菌亞單位疫苗，其特征在于：所述融合蛋白FlaA-OmpK的制備包括如下步驟：

(1)以副溶血弧菌的DNA為模板,?進行PCR擴增，分別獲得目標基因flaA和ompK；

(2)采用重疊延伸PCR技術(shù)，獲得融合蛋白基因flaA-ompK；

(3)選用表達載體pET-28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒flaA-ompK—pET-28a；轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21，篩選轉(zhuǎn)化子；在IPTG誘導下表達目標蛋白；經(jīng)鎳柱親和層析法純化得到融合蛋白FlaA-OmpK。