[發(fā)明專利]一種金屬鎘抗性相關(guān)蛋白DbsCPA2及其編碼基因和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110426759.2
• 申請日: 2011-12-19
• 公開（公告）號: CN102432677A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳亮;謝麗娟;胡敏;俞陸軍;廖斌;束文圣
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C07K14/245
• 分類號: C07K14/245;C12N15/31;C12N15/63;C12N15/70;C12N1/21;A62D3/02;C12R1/19;A62D101/43
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金屬鎘抗性相關(guān)蛋白DbsCPA2及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用、工業(yè)發(fā)展，重金屬對環(huán)境造成的污染日趨嚴(yán)重，土壤重金屬污染已經(jīng)成為一個危害全球環(huán)境質(zhì)量的問題。土壤重金屬會影響植物的生長發(fā)育，降低農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，受土壤重金屬污染的作物在植物體中積累，并通過食物鏈富集到人體和動物體中，危害人畜健康，引發(fā)癌癥和其他疾病等。治理重金屬污染刻不容緩，各種修復(fù)技術(shù)和措施正在研究和應(yīng)用中。各國政府和科學(xué)家著力通過兩個途徑解決這一問題：一為利用物理的，化學(xué)的方法試圖清除土壤或水體的重金屬污染：二為利用現(xiàn)代生物技術(shù)清除污染。自從20世紀(jì)80年代以來，生物修復(fù)技術(shù)因其具有處理費(fèi)用低、對環(huán)境影響小、效率高等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到廣大科技人員的廣泛關(guān)注。生物修復(fù)一般分為植物修復(fù)、動物修復(fù)和微生物修復(fù)三種類型，其中植物修復(fù)和微生物修復(fù)是研究的熱點(diǎn)。微生物修復(fù)就是利用微生物將環(huán)境中的污染物降解或轉(zhuǎn)化為其他無害物質(zhì)的過程。近年來，基于微生物對重金屬的作用機(jī)理，以修復(fù)有毒有害金屬污染或回收有經(jīng)濟(jì)價值重金屬為目的的生物處理技術(shù)日趨成熟。植物修復(fù)指利用植物去治理水體、土壤和底泥等介質(zhì)中的污染的技術(shù)。然而用于重金屬污染修復(fù)的生物往往會受到重金屬的毒害，生長緩慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金屬對植物和微生物的毒害作用是生物修復(fù)的主要限制因素。

解決生物修復(fù)中重金屬對生物的毒害作用的根本途徑在于研究耐受重金屬的分子生物學(xué)機(jī)制，克隆對重金屬耐受的關(guān)鍵基因，通過基因工程手段獲得用于生物修復(fù)中性能優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因工程生物。

由于技術(shù)上的原因，直到最近，對微生物基因資源的利用主要局限于可培養(yǎng)微生物。然而，已培養(yǎng)微生物僅占自然界中微生物的不到1%，因此各種生境中的微生物宏基因組是一個巨大而未發(fā)掘的基因資源庫。極端環(huán)境具有豐富的微生物資源，當(dāng)中許多與逆境和關(guān)鍵生命過程相關(guān)的基因在長期的適應(yīng)進(jìn)化中獲得了更強(qiáng)的耐性潛能，發(fā)掘這些抗性基因已成為國際重要的研究熱點(diǎn)。酸性礦山廢水(AMD)是極端生境微生物學(xué)研究的重要系統(tǒng)。AMD來源于采礦活動使含硫礦物(主要為黃鐵礦,?FeS₂)暴露于空氣和水中，在微生物催化作用下迅速氧化產(chǎn)酸所致，其pH值一般在1-?4左右，而且富含硫酸鹽以及Pb、Zn、Cu、Cd和Ni等重金屬，是采礦業(yè)面臨的最嚴(yán)重環(huán)境問題之一。在AMD中生存的原核微生物在長期的進(jìn)化過程中逐漸形成了一些獨(dú)特機(jī)制，以應(yīng)對低pH值、高鹽度以及高重金屬等多種極端環(huán)境協(xié)迫。因此，AMD生境成為極具特色和豐富的抗逆基因庫。

鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過控制K+在細(xì)胞中的吸收和排出，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)pH和細(xì)胞膨壓，對細(xì)胞的生長和生存起著重要的作用。鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有三種類型：鉀離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Trk）、鉀離子通道（Kch）、鉀離子外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Kef）。目前研究的最清楚的是大腸桿菌的鉀離子外排系統(tǒng)（Kef）。

Kef是一個位于細(xì)胞膜內(nèi)膜的K⁺/H⁺反向運(yùn)輸?shù)鞍住ef由一個N端疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域和一個C端親水性KTN(potassium?transport?and?NAD-binding?domain)結(jié)構(gòu)域組成。Kef的活性由谷胱甘肽控制：還原型谷胱甘肽抑制Kef的活性；谷胱甘肽加合物激活Kef蛋白。Kef在激活的狀態(tài)把細(xì)胞內(nèi)的K⁺排除細(xì)胞外，同時將細(xì)胞外的H⁺運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞質(zhì)酸化。

大腸桿菌暴露在有毒的親電試劑下，例如丙酮醛，?Kef有利于提高大腸桿菌的的生存能力。當(dāng)細(xì)胞受到親電試劑的毒害時，細(xì)胞質(zhì)中的谷胱甘肽與親電試劑結(jié)合，形成谷胱甘肽加合物，谷胱甘肽加合物能夠激活Kef，將K⁺從細(xì)胞質(zhì)排出，同時H⁺運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞質(zhì)酸化。細(xì)胞質(zhì)酸化能夠抵抗有毒親電試劑的進(jìn)攻，同時防止DNA損傷。

Roosild?(2009)等人研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽以及谷胱甘肽加合物通過與Kef的羧基端的KTN結(jié)構(gòu)域結(jié)合，控制Kef的活性。因此，KTN結(jié)構(gòu)域?qū)τ诟兄?xì)胞內(nèi)信號和調(diào)節(jié)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化都十分重要。KTN結(jié)構(gòu)域比較小，大約有140個氨基酸，靠近跨膜結(jié)構(gòu)域位置的氨基酸也非常保守。這些充分說明了為什么KTN結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)K⁺在細(xì)胞膜內(nèi)外流動的重要性。

然而，迄今為止Kef基因在微生物中對重金屬鎘抗性究竟起什么作用仍不清楚，也沒有從AMD微生物中克隆到Kef基因的報道。