[發明專利]小桐子高頻再生方法

有效

• 申請號: 201110426508.4
• 申請日: 2011-12-19
• 公開（公告）號: CN102524065A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 孫懷娟;孔曉香;陳小蓮;李艷梅;李耿光
• 申請（專利權）人: 普羅米綠色能源（深圳）有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 深圳市維邦知識產權事務所 44269
• 代理人: 黃莉

技術領域

本發明涉及生物組織培養育苗技術領域，尤其涉及小桐子高頻再生方法。

背景技術

小桐子（Jatropha?curcas?L.），又叫麻瘋樹、麻風樹、膏桐、黑皂樹、木花生、油蘆子、亮桐、臭梧桐等，屬大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（JatrophaL.），落葉灌木或小喬木，是一種多年生木本油料植物。小桐子原產美洲，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區。

小桐子可全株開發，其果實、枝、葉均能利用。小桐子種子含油率高，經過加工可制成生物柴油。小桐子種子、樹皮、葉、根和乳汁中含有多種成分的生物藥源，可提取制作生物醫藥和生物農藥。小桐子種子加工后的油餅蛋白質含量較高，脫毒后可制作生物飼料,未脫毒的可制作優質的有機生物肥。另外，小桐子莖葉有毒，牲畜不吃，病蟲較少，不易燃燒，可作為田間地邊的生物籬和防風防火屏障。培育小桐子能源林,利用其種子提煉生物柴油是小桐子產業發展的主要方向。

我國現有栽培和半野生的小桐子，其繁殖主要靠種子繁殖和扦插繁殖，繁殖的周期長，成本高。又因其為木本植物，采用常規育種來改變其遺傳性狀相當困難，因此采用現代生物技術如轉基因技術等成為首選。一些國家和地區已經開始了對小桐子進行了分子水平的育種工作。選育的優良品種大量繁殖，通過組培方式快速繁殖小桐子將在小桐子選育種生產上有重要的應用價值。

目前，關于小桐子的組織培養及快速繁殖的報道較多，例如：陸偉達、魏琴、唐琳等人發表《麻瘋樹愈傷組織的誘導及快速繁殖》（《應用與環境生物學報》2003年第9卷第2期，第127~130頁）；陳金洪、高敏、黃記生等人發表的《麻瘋樹莖段離體培養及快速繁殖研究》（《廣西農業科學》2006年第37卷第3期，第221~223頁）等，然而這些現有繁殖方法存在以下不足之處：1.均采用不同的激素濃度組合誘導愈傷組織和芽分化，未涉及采用高濃度單激素誘導愈傷組織實驗；2.所采用不同激素配比中，單個激素的濃度均在0.01~3mg/l；3.均采用不同外植體誘導愈傷組織，愈傷組織誘導率40~80%，但不定芽的分化率相差極大，為0~80%。

發明內容

本發明實施例所要解決的技術問題在于，提供一種小桐子高頻再生方法，以提升高頻再生率。

為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：一種小桐子高頻再生方法，包括如下步驟：

獲得無菌苗步驟，選取飽滿的野生小桐子種子，剝去外殼，消毒處理后再剝離胚乳，將完整的種子胚和子葉接種在萌發培養基上萌發培養，獲得無菌苗；

愈傷組織初次誘導步驟，剪取無菌苗長勢好的子葉再切成子葉小塊并接入愈傷組織初次誘導培養基黑暗培養7~11天，該愈傷組織初次誘導培養基成分為：MS培養基+0.5?~8.0?mg/L吲哚丁酸，PH值5.8；

愈傷組織再次誘導步驟，取出經過初次誘導的愈傷組織，轉入愈傷組織再次誘導培養基黑暗培養12~14天，該愈傷組織再次誘導培養基成分為：MS培養基+0.1~2.0?mg/L?6-芐基嘌呤+0.05?~1.0?mg/L吲哚丁酸；

再生芽誘導步驟，取出經過再次誘導的愈傷組織轉入不定芽誘導培養基光照培養直至獲得分化出的不定芽，該不定芽誘導培養基成分為：MS培養基+0.5~1.5?mg/L?6-芐基嘌呤+0.05?~0.1?mg/L吲哚丁酸+0~1.0?mg/L的赤霉素；

生根培養步驟，選取莖葉生長均勻的不定芽切下，并在0.1~2.0?mg/L的吲哚丁酸或生根粉中浸泡5~120min，接入生根培養基進行生根培養，該生根培養基成分為：1/2MS培養基+0~2?mg/L吲哚丁酸；

煉苗移栽步驟，選擇長出至少3條長度超過3cm的根的生根苗，煉苗移栽。

進一步地，萌發培養基主要包括MS培養基，pH值5.8，每瓶培養基接2-3顆，接好的材料在24-26℃下先在暗培養3~5天再光照培養，光照12-16h/天，光照強度1600-2000?lx，光照培養10-12天后獲得無菌苗。

進一步地，所述萌發培養基中還加入有3.0%蔗糖和0.7%瓊脂。

進一步地，愈傷組織初次誘導步驟中，切好的子葉塊是正面朝上地接入愈傷組織初次誘導培養基。

進一步地，愈傷組織初次誘導步驟中，將無菌苗長勢好的子葉放入墊有無菌濾紙的滅菌的盤中，加入無菌水，將子葉切成0.3~0.5cm²大小的小塊，愈傷組織初次誘導培養時，溫度為24~26℃。

進一步地，愈傷組織再次誘導步驟中，培養溫度為24~26℃。