[發明專利]金華豬成纖維細胞系的建立及其培養方法

無效

• 申請號: 201110425852.1
• 申請日: 2011-12-19
• 公開（公告）號: CN102409021A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 郝柱;王穎;彭靜;沈一飛;郭曉令;徐寧迎
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明涉及細胞生物學領域，尤其涉及一種金華豬成纖維細胞系的建立及其培養方法。

背景技術

畜禽遺傳資源保護問題最早于50年代在美國提出。自1972年斯德哥爾摩人類環境會議以后，引起聯合國糧農組織(FAO)與環境規劃署(UNEP)的重視，他們聯手在全球開展了家養動物遺傳資源的保護行動，至今前后進行了幾十年的工作，取得了明顯的成效。我國從開始就參加了他們組織的一系列計劃與行動。但目前中國的畜禽遺傳資源保護形勢并不樂觀。在80年代進行的普查中，估計共有品種600個，其中本國地方品種有385個。有10個地方品種已經滅絕，8個品種瀕臨滅絕。20個品種的有效群體含量急劇下降，占調查品種數364個的13%。又據中國農科院畜牧所與全國畜牧獸醫總站種畜禽處在2000年完成的“畜禽遺傳資源多樣性補充調查”的資料稱，在調查的17個省區的331個品種中，處于瀕危與將要滅絕的品種有59個，占調查總數的18%另有7個品種已經滅絕，例如云南的大普吉豬，浙江的蕭山雞、文山鵝、思茅鵝、草海鵝等。

我國畜禽遺傳資源豐富，它們在畜牧生產和新遺傳資源形成過程中發揮了非常重要的作用。近2O年來，為滿足人民對肉、蛋、奶、蜜等畜產品的需求，我國相繼引進了大量的外來高產品種對低產地方品種進行改良，使畜牧生產水平大幅提高。但改良的消極后果使某些地方品種逐漸被培育品種或雜交種所取代，致使具有豐富多樣性的地方品種群體數量下降或消失。最近研究表明，50%?以上地方畜禽品種的群體數量處于不同程度的下降，其中一定數量處于瀕危狀態。國內外多年來對保種工作的實踐與經驗，告訴我們要有效保護地方優良的畜禽資源關鍵是要采用經濟合理的方法，即使得畜禽資源得到很好的保護又要節約成本。這里應用細胞生物學方法建立畜禽的細胞系就是一個有效經濟的方法。在建立細胞系的過程中同時對詞細胞的基本生物學特性進行研究，為以后進一步的研究提供技術與理論支持。

金華豬是中國著名的地方品種。又稱兩頭烏，產于浙江東陽、義烏、金華等地。據金華縣古方出土的西晉（公元265-316年）陶豬和陶豬圈考證，早在1600年前這一帶的養豬業已相當發達。相傳在古代就有“家鄉肉”的腌制品，爾后演變成火腿。隨著火腿遠銷，金華豬也隨之揚名。金華豬體型中等，耳下垂，頸短?粗，背微凹，臀傾斜?、蹄質堅實。全身被毛中間白，頭頸、臀尾黑。以早熟易肥?、皮薄骨細、肉質優良、適于腌制火腿著稱。7～8月齡、體重70～75千克時為屠宰適期，胴體瘦肉率40％～45％。目前，由于外來豬種的大量引進和一些社會因素的干擾使得金華豬的種群數量持續減少，肉品質持續下降，應該采取有效措施加強金華豬的保種。

細胞生物學研究一直都很受人們的重視，隨著科學研究的發展，人們對細胞的研究也越來越深入，細胞生物學的發展為其它生命科學的發展提供了研究基礎，也可以說細胞生物學是其它生命學科發展的前提。這也從另一個側面反映出畜禽資源細胞保存的重要性。這些種質資源一旦失去就無法再進行研究與應用，所以很多國家目前都致力于種質資源的保存。我國保護物種多樣性方面也面臨著許多問題需要解決。

哺乳動物核移植技術的發展也日趨完善，細胞核移植技術是將供體細胞核移入出去核的卵母細胞中，使后者不經過精子穿透等有性過程即無性繁殖即可被激活、分裂并發育成新個體，使得核供體的基因得到完全復制。它在動物育種、制備轉基因動物、基因治療及器官移植等方面具有重大的作用，而成纖維細胞是核移植中的一種理想的供體細胞。金華豬作為一個優良的地方豬種，它在育種方面具有巨大的潛力，而且豬也是一種人類器官的比較優良的提供者，因而金華豬成纖維細胞的建系具有重要的科研與生產價值。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種金華豬成纖維細胞系的建立及其培養方法。

為實現上述目的，本發明采取以下技術方案：

金華豬成纖維細胞系的培養方法的步驟如下：

1）初代培養：快速從懷孕母豬子宮中取出40日齡的胚胎，用加雙抗的PBS清洗3~4次；用眼科剪和眼科鑷分離背最長肌，再用加雙抗的PBS清洗3~4次，然后剪成0.5~1.0mm³的組織塊；將組織塊移入培養瓶并涂布均勻，倒置培養瓶，放入37~39℃，體積百分數為5%CO₂的培養箱中培養3~4h；組織塊完全貼壁后加入10ml的培養液，培養液成分：DMEM+10%胎牛血清繼續培養8~12個小時；