[發(fā)明專利]一種錦鯉鰭條組織細胞系及構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110424748.0
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102399743A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾令兵;肖藝;徐進;范玉頂;周勇;張輝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種錦鯉鰭條細胞系，同時還涉及一種錦鯉鰭條細胞系的構(gòu)建方法，適用于淡水魚類細胞系建立與鯉皰疹病毒病原的分離培養(yǎng)及診斷。

背景技術(shù)

錦鯉(Cryprinus?carpiod)，以其絢麗的色彩、華麗的斑紋、雄健的身軀、溫順的習(xí)性而享譽世界，被人們稱為“水中瑰寶”、“會游泳的藝術(shù)品”，是世界上最受歡迎的大型觀賞魚之一。錦鯉除具觀賞價值外，還是營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)細嫩的食用魚。

近年來，隨著環(huán)境污染的日益加劇和養(yǎng)殖業(yè)的過度膨脹，錦鯉的病害問題日趨嚴重，各種傳染性疾病尤其是病毒病的暴發(fā)，造成錦鯉死亡率逐年上升，極大地影響了錦鯉養(yǎng)殖業(yè)、觀賞業(yè)、國際貿(mào)易出口業(yè)，經(jīng)濟損失嚴重。錦鯉皰疹病毒病由錦鯉皰疹病毒(Koi?Herpesvirus，KHV)引起，主要感染錦鯉和鯉魚，是錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)生的一種高致病性疾病，發(fā)病率和致死率均可高達80％-100％。1998年在以色列的Magan?Michael地區(qū)暴發(fā)了錦鯉疾病，經(jīng)鑒定其病原為KHV，導(dǎo)致漁場損失肉用鯉魚600噸，出口損失近400萬美元。隨后該病傳播與蔓延到美國、歐洲大陸、亞洲等；近年來我國已有該病毒病例的報道。KHV非常特殊，只能在源自于原始宿主細胞中增殖，即在錦鯉細胞中增殖，很難在魚類病毒分離常用的細胞系中增殖。目前，國外常用錦鯉鰭條細胞系KF-1和普通鯉魚腦細胞系CCB進行該病毒培養(yǎng)，但國內(nèi)未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供一種錦鯉鰭條組織細胞系的建立方法，即通過組織塊移植法建立一種錦鯉鰭條細胞系。組織塊的存在，為遷出細胞提供了良好的生長基質(zhì)和環(huán)境，對適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境和促進細胞生長有重要作用，從組織塊中遷移出來的細胞貼壁穩(wěn)定、生長迅速，可生長成穩(wěn)定的單層細胞；該方法具有操作方便、快速、效率高等特點，是常用的細胞原代培養(yǎng)方法之一。目前錦鯉皰疹病毒不僅感染錦鯉，而且已經(jīng)在我國較大的范圍內(nèi)感染養(yǎng)殖鯉魚，造成重大經(jīng)濟損失。在開展錦鯉皰疹病毒病原分離鑒定、疫病診斷與防控技術(shù)研究中，缺乏錦鯉皰疹病毒的敏感細胞系。本發(fā)明工藝科學(xué)合理，經(jīng)這種方法建立的錦鯉鰭條細胞系，目前已傳至60多代，對錦鯉皰疹病毒敏感，可望今后應(yīng)用于錦鯉皰疹病毒的分離鑒定、病毒體外擴增、疫病診斷、病毒疫苗制備以及錦鯉疹病毒病的基礎(chǔ)理論研究與免疫防治技術(shù)等方面的研究。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種錦鯉鰭條組織細胞系(Koi-Fin)的構(gòu)建方法，其步驟是：

1.錦鯉鰭條組織塊的制備：首先將錦鯉放置在濃度為15-25克/升的高錳酸鉀溶液中，消毒處理30-40min后再用70％(V/V)酒精擦拭魚體表面，在II級生物安全柜(新加坡，ESCO)里無菌取出背鰭、腹鰭組織。用含450-550單位/毫升青霉素(Sigma)、450-550微克/毫升鏈霉素(Sigma)、12.0-13.0微克/毫升兩性霉素B(Sigma)的磷酸緩沖液洗滌鰭條組織3～4次，用滅菌的眼科剪子將鰭條組織剪成約1mm³左右的碎塊，均勻移植到25毫升細胞培養(yǎng)瓶(Coring)里，于23-25℃培養(yǎng)箱里倒置干貼1.5-2.5小時。

2.錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養(yǎng)液的配置：取6.8-7.2毫升pH值為7.0-7.4的MEM培養(yǎng)基(Sigma)，加入1ml胎牛血清(Hyclone)，為了促進錦鯉鰭條組織細胞的分裂和快速增殖，在上述培養(yǎng)液中添加0.01‰-0.02‰(W/V)的堿性纖維生長因子、0.01‰-0.02‰(W/V)表皮生長因子。

3.錦鯉鰭條組織細胞的原代培養(yǎng)：將每瓶干貼后鰭條組織中添加專用增殖培養(yǎng)液，于23-25℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，待觀察到細胞從鰭組織周圍遷出后，每隔3-5天半量更換錦鯉鰭條組織專用增殖培養(yǎng)液，即用移液管從每個細胞培養(yǎng)瓶里吸出2.5ml培養(yǎng)液，以去除未貼壁的組織塊以及死細胞，并添加2.5ml新鮮的錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養(yǎng)液。