[發明專利]一種小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體及免疫熒光檢測方法

有效

• 申請號: 201110424715.6
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102399753A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 高利;陳萬權;劉太國;劉博
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/14;G01N33/577
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明屬于生物檢測技術，涉及一種小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體以及免疫熒光檢測法。

技術背景

小麥矮腥黑粉菌(Tilletia?controversa?Kühn，簡稱TCK)引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國際檢疫性病害，對小麥生產具有毀滅性危害，也是我國外來生物入侵研究的主要物種之一(王圓.小麥矮腥黑穗病菌[M].中國進境植物檢疫有害生物選編，中華人民共和國動植物檢疫局和農業部植物檢疫實驗所編，北京：中國農業出版社，1997，95～98)。在小麥矮腥黑穗病流行年份引起的產量損失一般為20～50％，嚴重時可達75～90％，甚至絕產。病菌抗逆性極強，其冬孢子在土中可存活3～7年，包裹在菌癭中的冬孢子甚至可保持活力長達10年以上。此病害一旦發生，很難防治或根除，所以國際上有15個國家將其列為檢疫對象加以防范。我國從20世紀60年代開始一直將此病害列為一類對外檢疫對象。在腥黑粉菌中，TCK與其近緣種小麥網腥黑粉菌在形態學上極為相似，難于區別。

傳統的病害診斷、檢測方法主要是依據病原形態學、生理學和生物化學的特性，不但過程繁瑣、時間周期長，而且準確性差、精度不高。分子生物學手段快速、準確地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的理論意義和實用價值。1996年Ferreira等(Ferreira?M.A.，Tooley?P.W.，Hatziloukas?E.etc.Isolation?of?a?species?specific?mitochondrial?DNA?sequence?for?identification?of?Tilletia?indica，the?Karnal?bunt?of?wheat?fungus[J].Application?Environment?Microbiology，1996，62：87～93)首次將PCR技術引進到印度腥黑穗病(Tilletia?indica?Mitra)的鑒定中來，他們選擇了印度腥黑粉菌線粒體DNA的一個2.3kb的EcoR?I片段進行了克隆和測序，設計的特異性引物Ti1/Ti4從25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另外，Smith等(Smith?O.P.，Peterson?G.L.Beck?R.J.etc.Development?of?a?PCR-based?method?for?identification?of?Tilletia?indica，causal?agent?of?karnal?bunt?of?wheat[J].Phytopathology，1996，86：115～122)通過克隆印度腥黑粉菌線粒體DNA的Dra?I片段，進行了序列分析，設計了兩套寡核苷酸引物對Ti17/M1和Ti17/M2，能分別從印度腥黑粉菌中擴增出大小為825bp和118bp特異性片段，也實現了對印度腥黑穗病的檢測鑒定工作。2000年Frederic等(Frederick?R.D.，Snyder?K.E.，Tooley?P.W.Identification?and?Differentiation?of?Tilletia?indica?and?T.walkeri?using?the?Polymerase?Chain?Reaction[J].Phytopathology，2000，90：951-960.)根據線粒體的差異設計了5對針對印度腥黑粉菌的特異性引物和3對針對黑麥草腥黑粉菌的特異性引物，分別能將印度腥黑粉菌菌株和黑麥草腥粉菌病菌株從其近緣屬種中鑒別出來。張競宇等(張競宇，張正光，鄭小波，等.小麥印度腥黑穗病菌的分子檢測[J].高技術通訊，2004，1：31～36)利用核糖體ITS序列上的差異在Tilletia屬20個種中設計了一對特異性引物T1/T2，能將T.indica和T.walkeri從其它種中區分開來，而后又根據T.indica和T.walkeri線粒體之間的差異設計了一對特異性引物M1/M2，可以將二者區分開來，為了使反應更為靈敏，建立了套式PCR技術，以便于提供更簡單的鑒定方法。梁宏等(梁宏，彭友良，張國珍，等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌rDNA2IGS區的擴增及其序列分析[J].植物病理學報，2006，36(5)：407-412)依據核糖體的IGS1區特性，設計了一對特異性引物，可以將小麥光腥黑粉菌菌株從其近緣屬種中鑒別出來。2004年高強(高強.小麥矮腥黑穗病的分子檢測[D].長沙，湖南農業大學，2004)利用RAPD技術找到了一條可以將小麥網腥黑粉菌菌株和小麥矮腥黑粉菌菌株區別于其它黑粉菌株的條帶，但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網腥黑粉菌之間沒有找到有差異的條帶，沒能將二者分開。2006年周業琴，劉素萍等(周業琴，劉素萍，周國梁，等.水稻腥黑粉病菌的單孢檢測[J]。植物檢疫，2006，20：38～41)應用核糖體ITS序列的通用引物Til1/Til4和兩對特異性引物(Hor2/Hor9；Hm1/Hm5)結合建立了套式PCR技術，可以將水稻腥黑粉菌標定出來。本實驗室陳萬權、劉太國、劉建華利用AFLP技術，找到了小麥矮腥黑粉菌的特異性片段，能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣屬種中區分開來，該技術已經獲得國家發明專利，專利號為：200510080073.7，本實驗室的另外三個專利涉及采用ISSR的方法獲得小麥矮腥黑穗病的特異性分子標記，靈敏度分別可達到1ng/25ul.