[發明專利]以NF-κB為靶點的藥物篩選細胞模型及其構建和應用

有效

• 申請號: 201110423368.5
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102492657A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 王勤;楊金波;杜宇平;陳星
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/63;C12N15/11;C12Q1/66;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 張英荷

1.以NF-κB為靶點的藥物篩選細胞模型，其特征在于：利用含有NF-κB?特異性結合序列的報告系統載體，以具有組成型NF-kB?的活性細胞為基礎，構建成穩定的以NF-κB信號為靶點高通量藥物篩選細胞模型。

2.如權利要求1所述以NF-κB為靶點的藥物篩選細胞模型，其特征在于：所述NF-κB?的特異性結合序列為?5’-GGGRNNYYCC-3’；其中R為嘌呤，Y?為嘧啶，N?為堿基。

3.如權利要求1所述以NF-κB為靶點的藥物篩選細胞模型，其特征在于：所述報告系統載體是在含有熒光素酶報告基因的報告載體多克隆位點中插入包含有NF-κB?特異性結合序列作為報告系統載體的響應序列，構建成的報告系統載體。

4.如權利要求1所述以NF-κB為靶點的藥物篩選細胞模型，其特征在于：所述具有組成型NF-κB的活性細胞為DU145，前列腺癌細胞、HepG2，人肝癌細胞、H1299人肺癌細胞、A549人肺癌細胞、HCT119人結腸癌細胞、Hela人宮頸癌細胞、MCF-7人乳腺癌細胞、MDA-MB-468人乳腺癌細胞或?MDA-MB-231人乳腺癌細胞。

5.如權利要求1所述以NF-κB為靶點的藥物篩選細胞模型的構建，包括以下工藝步驟：

（1）報告系統載體構建：利用分子生物學方法在含有熒光素酶報告基因的報告載體多克隆位點中插入包含有NF-κB?特異性結合序列以及3’端含有?TATA?盒序列的?DNA?片段，作為報告系統載體的響應序列，構建成報告系統載體；

（2）細胞模型的構建：將報告系統載體轉染具有組成型NF-κB活性細胞后，用嘌呤霉素進行陽性克隆篩選，選取對NF-κB信號抑制劑有響應的克隆，即為以NF-κB為靶點的藥物篩選細胞模型。

6.如權利要求1所述以NF-κB為靶點的藥物篩選細胞模型用于篩選由NF-κB組成型活化造成的腫瘤及免疫疾病的治療藥物。

7.如權利要求6所述以NF-κB為靶點的藥物篩選細胞模型用于篩選由NF-κB組成型活化造成的腫瘤及免疫疾病的治療藥物，其特征在于：所述藥物篩選的方法包括以下工藝步驟：

（1）將所述藥物篩選細胞模型用100?μl培養基接種于96孔板中，培養至細胞匯合度為30%~40%；

（2）在培養基中加入待篩選化合物0.1?μl~2μl，繼續培養24?小時；

（3）在上述96孔板中加入50?μl穩定型熒光素酶底物，使用熒光/化學發光分析儀測定熒光強度并分析熒光抑制率，當熒光抑制率達到40%以上得到初篩產物；

（4）以化合物細胞毒性實驗消除化合物對細胞模型的直接損傷，熒光抑制率達仍在40%以上得到復篩產物，即為以NF-kB為靶點的抑制藥物。