[發(fā)明專利]增強(qiáng)子Hr3

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110423280.3
• 申請(qǐng)日: 2011-12-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102492692A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏慶友;王峰;徐漢福;馬三垣;趙萍;向仲懷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/10;C12N15/63;C12N15/85;A01K67/04
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物基因工程，特別涉及家蠶的轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著21世紀(jì)生物工程以及基因工程的迅速發(fā)展，人們對(duì)醫(yī)用、藥用、食用、美容、保健等各種用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然來(lái)源的蛋白質(zhì)提取和生產(chǎn)已無(wú)法滿足快速增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。建立和完善各種高效的原核和真核表達(dá)系統(tǒng)，并利用菌株、細(xì)胞和昆蟲(chóng)等作為宿主生物反應(yīng)器，是實(shí)現(xiàn)低成本、規(guī)模化生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的重組外源蛋白的有效和可持續(xù)方法，并成為當(dāng)今世界研究的熱點(diǎn)。利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白是目前最為標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)模式，但其運(yùn)營(yíng)成本和對(duì)環(huán)境的要求極為苛刻，嚴(yán)重限制了其大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了建立低成本、規(guī)模化、安全可持續(xù)的高效生產(chǎn)外源蛋白的生物工廠，自2000年以來(lái)，科研人員開(kāi)始嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因生物，如哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、昆蟲(chóng)以及植物的器官作為生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)重組外源蛋白。

家蠶以泌絲著稱，是最早被人類所完全馴化利用的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物（昆蟲(chóng)）之一。絹絲腺是合成、分泌蠶絲蛋白的唯一器官，為整個(gè)蠶絲業(yè)的生物學(xué)基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)數(shù)千年的人工馴化，家蠶的絹絲腺具備了超強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成與分泌能力，一頭體重5g左右家蠶能合成分泌約0.5g蠶絲蛋白，為目前已知昆蟲(chóng)之最。蠶絲蛋白主要由絲素蛋白（fibroin）和覆被在其外層的絲膠蛋白（sericin）構(gòu)成：絲素蛋白是蠶絲的主體，約占75%，由蠶的后部絲腺合成，包括fib-H鏈、fib-L鏈和P25三種主要組分，均不溶于水；其余為絲膠蛋白，約占25%，由蠶的中部絲腺合成，包括絲膠1(Sericin1）、絲膠2(Sericin2）和絲膠3(Sericin3）三種主要組分，其中又以絲膠1蛋白含量最高，均可溶于水。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，家蠶絹絲腺的高效合成與分泌絲蛋白這一特征，以及所具備的糖基化、甲基化等對(duì)外源蛋白保持活性極其重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工能力，飼養(yǎng)成本低，可工廠化生產(chǎn)，對(duì)人畜安全等特點(diǎn)，使其成為理想的生物反應(yīng)器模型，備受各國(guó)研究人員關(guān)注并競(jìng)相開(kāi)發(fā)利用。

2000年，田村等人利用pBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)顯微注射家蠶蠶卵并獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因家蠶；2003年，夏慶友等人完成了家蠶基因組計(jì)劃，家蠶絲腺中涉及絲蛋白合成的重要編碼基因如絲素重鏈(FibH?chain)基因、絲素輕鏈(FibL?chain)基因、絲膠1(Sericin1)基因、絲膠2(Sericin2)基因、絲膠3(Sericin3)基因以及P25基因等的啟動(dòng)子調(diào)控元件被鑒定和克隆，這些基礎(chǔ)研究結(jié)果使得利用轉(zhuǎn)基因家蠶組織特異表達(dá)系統(tǒng)，在絲腺中大規(guī)模生產(chǎn)重組外源蛋白成為可能。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外利用pBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及家蠶組織特異啟動(dòng)子元件在絲腺中嘗試表達(dá)了多個(gè)外源蛋白，包括：在后部絲腺表達(dá)了絲素重鏈融合的EGFP(Zhao?et?al.?2010)、貓干擾素（Kurihara?et?al.?2007)、蜘蛛絲牽引蛋白（Zhu?et?al.?2010)、人Ⅲ型膠原蛋白的部分肽段(Tomita?et?al.?2003)、增強(qiáng)型紅色熒光蛋白(Tomita?et?al.?2003)，絲素輕鏈融合的羥基脯氨酸膠原部分肽段(Adachi?et?al.?2006)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hino?et?al.?2006)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Shimizu?et?al.?2007)、部分膠原蛋白肽段（Yanagisawa?et?al.?2007)，以及P25融合的紅色熒光蛋白(Royer?et?al.?2005)等；在中部絲腺表達(dá)了人血清白蛋白（Ogawa?et?al.?2007)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Tomita?et?al.?2007)、鼠單克隆抗體(Iizuka?et?al.?2009)、人膠原蛋白α鏈基因(Adachi?et?al.?2010)以及可溶性GM-Csf受體α(Urano?et?al.?2010)等。但總體上，上述研究成果的產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)頗為困難，主要原因在于：在絲素中生產(chǎn)的外源蛋白雖具有較高的含量，但重組蛋白極難純化且易破壞其生物活性；在絲膠中生產(chǎn)的外源蛋白雖較容易純化，但利用現(xiàn)有絲膠表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白含量極低而難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。因此，針對(duì)外源蛋白表達(dá)合成的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，改造并建立新的高效、穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效生產(chǎn)，是解決上述瓶頸的根本出路。也是今后家蠶生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)的核心所在。