[發(fā)明專利]一種快速消除大腸桿菌抗生素抗性質(zhì)粒的方法

無效

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• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN103160493A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張震宇;劉合棟
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12N1/20;C12R1/19
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• 代理人: 暫無信息

1.一種快速消除大腸桿菌抗生素抗性質(zhì)粒的方法，其特征在于：將大腸桿菌進(jìn)行電擊后獲得消除抗生素抗性質(zhì)粒的大腸桿菌，并采用特殊的電擊緩沖液促進(jìn)抗生素抗性質(zhì)粒的消除，電擊緩沖液的堿金屬可促進(jìn)細(xì)胞膜的擊穿，使得胞內(nèi)質(zhì)粒更容易泄露出來，提高質(zhì)粒消除率。

2.如權(quán)利要求1所述的將大腸桿菌進(jìn)行電擊后獲得消除抗生素抗性質(zhì)粒的大腸桿菌，其步驟如下：

A、制備感受態(tài)細(xì)胞：

(1)從LB平板上挑取含抗生素抗性質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，接種到含有5ml的LBG培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；

(2)在無菌條件下，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至預(yù)冷、無菌1.5ml的離心管中；

(3)4000g離心10min回收菌體，該步驟在4℃下進(jìn)行；

(4)用1ml預(yù)冷的15％甘油重懸細(xì)胞沉淀；

(5)4℃以4000g離心10min后棄掉液體，回收菌體；

(6)重復(fù)步驟4、步驟5各一次；

(7)最后將菌體重懸于原體積1/10的10％甘油中，并分裝至1.5ml離心管中，每管90μl，并冷凍保存，備用；

B、電擊消除：

(1)將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化后，加入10μl特殊電擊緩沖液后混勻，并置于冰上放置10min；

(2)將感受態(tài)細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至1mm的電擊杯中，1.8KV/5ms電擊一次；

(3)電擊后立即加入1ml的SOC培養(yǎng)基(2％(W/V)蛋白胨，0.5％(W/V)酵母抽提物，0.05％(W/V)氯化鈉，2.5mM氯化鉀，10mM氯化鎂，20mM葡萄糖)，37℃溫育30min；

(4)將感受態(tài)細(xì)胞分別涂布至LBG平板和卡那霉素抗性平板中；

(5)將平板倒置后于37℃培養(yǎng)，24h后LBG平板和卡那霉素抗性平板均長出單菌落；

C、挑取質(zhì)粒消除菌：

(1)用滅菌的牙簽，將LBG平板上長出的菌落，分別接種到LBG固體平板和卡那霉素抗性平板中的相應(yīng)位置，過夜培養(yǎng)：

(2)將在LBG平板上生長而在卡那霉素抗性平板上不生長的菌落挑出，再分別接種到LBG固體平板和卡那霉素抗性平板中的相應(yīng)位置，過夜培養(yǎng)；

(3)挑出只在LBG平板上生長而在卡那霉素抗性平板上不生長的單菌落；

(4)挑出單菌落后，提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒是否消除；

3.如權(quán)利要求1所述的采用特殊的電擊緩沖液，該電擊緩沖液配方為：

KCl????0.5M

CaCl₂??0.15M

MgCl₂??0.25M

K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺這幾種帶正電荷配體，均可與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞膜的擊穿，使得胞內(nèi)質(zhì)粒更容易泄露出來，可提高質(zhì)粒消除率。?