[發明專利]高密度微生物混合發酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法

有效

• 申請號: 201110422241.1
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102559830A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 尚龍安;黃錦標;張艷輝;金志華;王曉燕;江岷
• 申請（專利權）人: 浙江大學寧波理工學院
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P7/62;C12R1/01;C12R1/38;C12R1/40
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務所(普通合伙) 33228
• 代理人: 代忠炯

技術領域

本發明屬于發酵工程技術領域，具體涉及一種高密度微生物混合發酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法。

背景技術

伴隨石油化工的發展，合成塑料已成為人們生活和生產密不可分的工業產品。但是大量不可降解塑料的廢棄已造成愈來愈嚴重的“白色污染”，日益威脅著人類賴以生存的環境，因此開發可生物降解的塑料已成為當務之急。目前采用生物技術生產的生物可完全降解的塑料中，研究得比較多的有兩類：聚乳酸和聚羥基烷酸酯。尤其后者的物化性能與聚丙烯相近，還具有生物相容性、光學活性、壓電效應、低透氧性、抗紫外線和抗凝血性等許多獨特的優點，在醫用產品領域也有廣泛的用途。

臨床醫學研究表明：含苯基功能團的有機物苯乙酸和苯丁酸等具有抗腫瘤、鎮痛和化學預防治療等功能。如果將苯基功能團引入生物高分子聚合材料----聚羥基烷酸酯中，合成出具有優良物理化學和機械性能的含苯聚羥基烷酸酯(PHPhA)，利用它在降解過程中緩慢釋放出含苯基功能團的有機酸如苯乙酸、苯丁酸等的特點，從而使生物可降解醫用材料聚羥基烷酸酯在使用過程中具有抗腫瘤、鎮痛等新的醫學作用，可為擴大該類生物高分子材料在醫學方面的應用奠定良好的基礎。

不含苯基功能團的聚羥基烷酸酯的生物合成技術已經基本成熟，如利用發酵法合成聚羥基丁酸酯(PHB)的濃度可達到每升140克，合成的羥基丁酸和羥基戊酸共聚物的濃度能達到每升50～90克左右，這使它們的生產成本大幅度降低，具備了工業化規模生產的條件。但是利用微生物以含苯有機物(如苯戊酸、苯乳酸等)為碳源合成含有苯基功能團的聚羥基烷酸酯時，由于通常微生物代謝含苯有機物的速率較低，而且有機物碳源對細胞生長有明顯抑制作用等原因，使得最終得到的細胞濃度和產物濃度都較低。近期報道的兩段流加式高密度發酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，可有效地降低有機物碳源對細胞生長抑制作用，從而使得發酵果汁最終得到的細胞濃度可以達到35.3克/升，產物聚羥基苯烷酸酯的濃度達到12.3克/升。但發酵過程分為兩段，兩段之間要調換不同的調節pH值所用的堿液，同時兩段發酵過程中補給的料液也不同，使得發酵過程操作、控制較為復雜。再加之發酵過程中僅僅利用單一菌種如Pseudomonas?putida發酵合成的含苯羥基烷酸酯共聚物中、單體絕大部分都是中長鏈(六個碳或以上)烷酸酯單體，短鏈(4個碳或以下，或5個碳)烷酸酯單體含量低，導致其材料難于加工成型，大大地限制了它的應用范圍。

此外，利用單一菌種微生物發酵合成聚羥基烷酸酯時，因微生物特性所定，其代謝產物聚羥基烷酸酯往往主要由短鏈單體組成，或者主要由中長鏈單體組成，很難調節和控制聚羥基烷酸酯產物中短鏈單體和中長鏈單體的比例，以使其產物的物理化學性能難以調控，大大地限制了它的使用范圍。

發明內容

本發明針對現有技術的上述不足，提供一種利用微生物混合發酵、多種碳源分段補給來合成既含有短鏈單體又含有中長鏈單體的含苯聚羥基烷酸酯，并能有效地大范圍調控其產物組成、而且操控過程簡單的高密度微生物混合發酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法。

為了解決上述技術問題，本發明的技術方案為：高密度微生物混合發酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，合成方法包括：

(1)在發酵培養基中加入磷酸鹽作為微生物生長代謝所必須的磷營養元素的供體，同時在發酵培養基中加入含苯有機物和糖作為碳源，然后將兩種或兩種以上的微生物接種到發酵培養基中于發酵罐內進行混合發酵培養；

(2)以1vvm的流量將無菌空氣或富氧氣體(如工業級的氧氣)連續通入步驟(1)中的發酵罐內，控制發酵罐的攪拌轉速為150～800轉/分鐘，發酵溫度為微生物生長的適宜溫度，發酵液中溶解氧濃度高于微生物生長代謝的需求值；并利用氨水調節pH為微生物生長的適宜pH值(如果不用氨水而用氫氧化鈉溶液來調節pH值時，在發酵過程中需要補給一定量的氮源如硫酸銨，以保證發酵過程中微生物對氮的需求量)；

(3)發酵過程中利用在線信號(如溶氧濃度、pH、在線糖濃度分析儀等)判斷發酵過程中碳源(糖和含苯有機物等)的消耗量，適時流加碳源以保證微生物的生長所需碳源，使發酵罐內含苯有機物的濃度在0.5克/升以下，不對微生物生長造成抑制作用；糖的濃度不大于20克/升；隨著發酵的進行，發酵液中營養元素磷的濃度不斷降低，當發酵液中的磷濃度逐漸降低至0.1克/升時，造成發酵液中磷源的供給不足，實現了磷限制；此時，流加到發酵罐內的含苯有機物和糖通過微生物代謝合成轉化為聚羥基苯烷酸酯(是指磷限制之后再流加的含苯有機物和糖)。