[發明專利]旋毛蟲與腫瘤相關蛋白基因制備方法和醫用用途

無效

• 申請號: 201110421996.X
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102433343A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 張西臣;李建華;任保彥;宮鵬濤;程柏淇;張國才;張楠;楊舉;李赫;陳玉江
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;A61K48/00;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

?本發明提供了旋毛蟲與腫瘤相關蛋白基因及其制備方法，本發明還提供了該蛋白的醫用用途，屬于生物制藥領域。

背景技術

旋毛蟲是一種寄生于人和多種動物體內的線蟲，近年來研究發現其具有較強的抗腫瘤活性，但對其抗腫瘤活性成分尚不清楚。據報導惡性腫瘤細胞對異體鑒識物比較敏感，異體抗原物所產生的免疫細胞對惡性腫瘤具有抵抗力。旋毛蟲與腫瘤細胞相關基因蛋白能產生針對腫瘤強的特異性和非特異性免疫反應。

發明內容

本發明提供了旋毛蟲與腫瘤細胞相關蛋白基因，為一種新的蛋白基因物質，具有生物活性。

本發明還提供了該相關基因蛋白的制備方法，適用于工業化生產。

本發明進一步公開了該蛋白的醫用用途，用于制備治療腫瘤的藥物。

本發明公開的旋毛蟲與腫瘤細胞相關蛋白基因，如SEQ?ID?NO.1所示。具有以下表征：

本基因蛋白是通過利用抗SP2/0高免血清對旋毛蟲cDNA文庫進行免疫篩選獲得的，對陽性克隆進行擴增，得到全序列長有569bp，含有411bp的開放性閱讀框，起始密碼子ATG，終止密碼子TGA，將其ORF命名為TS411。編碼136個氨基酸。

推測它的分子量（MW）為15.6?KD。根據滴定曲線推測其等電點（pI?：Isolectric?Point）為10.56。測序結果經登陸NCBI?BLAST核酸同源性檢索為旋毛蟲基因,與旋毛蟲核糖體蛋白S24基因的同源性為99%。ORF中有兩個堿基存在差異，分別是地135位的C-A，第327位達到A-G，對應的氨基酸有一位存在差異，即45位的Asp-Glu，第109位是同義突變。應用DNAStar軟件對TS411蛋白的抗原表位進行預測，發現其存在六個潛在的抗原表位位點。

本發明相關蛋白基因的制備方法如下：

利用酶聯免疫吸附試驗確定腫瘤細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細胞陽性血清間存在相關抗原；利用SP2/0??高免血清對旋毛蟲cDNA表達文庫進行篩選，得到本相關蛋白基因。

下述的藥理實驗證實了本發明蛋白基因具有顯著的抑制腫瘤生長的作用，可以作為制備抗腫瘤藥物被應用。

旋毛蟲與腫瘤相關蛋白基因抗腫瘤效果

將18～22g的BalB/C小鼠隨機分為TS411原核表達蛋白肌肉免疫組、TS411原核表達蛋白腹腔免疫組、TS411真核質粒免疫組、PBS對照組，免疫佐劑對照組，pVAX-1質粒對照組，每組10只。分別將原核表達的相關抗原200μg（2μg/μL）與等量的弗氏完全佐劑乳化均勻，肌肉/腹腔免疫。將真核質粒100μg（1μg/μL）與等量的司本甘油佐劑均勻混合，肌肉注射。兩周后，分別以200μg(2μg/μL)加入等體積的弗氏不完全佐劑進行第二次肌肉/腹腔免疫。將真核質粒100μg（1μg/μL）與等量的司本甘油佐劑均勻混合，肌肉注射。各照組則與實驗組平行進行首免和第二次免疫。按分組情況，第二次免疫后三天于每只小鼠的右后肢皮下注射接種1×10⁶個SP2/0細胞。荷瘤30d后，頸椎脫臼處死各個實驗組小鼠，并進行腫瘤體積、重量等物理指標的測定以及CD3⁺、CD4^+?、CD8⁺、CD19⁺等免疫指標的檢測。所有結果數據均利用SPSS?14.0?for?Windows?軟件進行分析，檢驗差異顯著性。

抗腫瘤試驗結果：?

結果表明

TS411基因真核質粒免疫組、TS411基因原核表達蛋白腹腔免疫組、TS411基因原核表達蛋白肌肉免疫組的體內平均抑瘤率分別為：28.3%，24.7%，21.3%。接種相關蛋白基因實驗組的瘤重顯著低于空白對照組（P<0.01）,各組蛋白基因的抗腫瘤情況見表1）。方差分析結果表明各組瘤重有顯著差異。組間檢驗結果顯示，不同免疫途徑的抑瘤率沒有顯著差異。

表1?相關蛋白基因對SP2/0骨髓瘤細胞荷瘤小鼠腫瘤重量和腫瘤體積的影響(???????????????????????????????????????????????±s,n=10)