[發明專利]一種將穿梭質粒導入嗜醋酸棒桿菌的電轉化方法

無效

• 申請號: 201110421135.1
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN103160535A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 張震宇;劉合棟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N1/21;C12R1/15
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種制備高效感受態細胞的方法，使得大腸桿菌和嗜醋酸棒桿菌中穿梭表達的重組質粒能快速有效地電轉化導入嗜醋酸棒桿菌中。

本發明通過控制培養基的組成、細胞培養時間、氨芐青霉素處理時間和加入量、質粒的甲基化、熱擊時間利熱擊溫度、電擊條件來制備高效電轉化感受態細胞，減弱嗜醋酸棒桿菌細胞壁對穿梭質粒的阻礙作用，并減少嗜醋酸棒桿菌對穿梭質粒的限制性酶切作用，使得穿梭質粒能夠通過電轉化方法高效地導入到嗜醋酸棒桿菌中，電轉化效率達到6.4×104cfu/μg?DNA。

1.一種能在大腸桿菌和嗜醋酸棒桿菌中穿梭表達的重組質粒電轉化導入到嗜酸棒桿菌的快速有效的方法，其特征在于：利用大腸桿菌SCS110大量擴增重組質粒，并用專用培養基和氨芐青霉素對嗜醋酸棒桿菌進行前培養，破壞細胞壁結構，電擊時加入電擊緩沖液以及電擊后熱激處理。

2.如權利要求1所述的特殊的大腸桿菌大量擴增重組質粒，其特征在于利用特殊的大腸桿菌SCS110擴增重組質粒，由于SCS110為甲基化酶dam、dcm缺陷型菌株，因此在SCS110大腸桿菌內大量擴增的穿梭質粒不被甲基化修飾，棒狀桿菌的限制性內切酶系統可識別并降解經大腸桿菌甲基化后的穿梭質粒，利用甲基化酶缺陷型大腸桿菌SCS110來源的穿梭質粒做電轉化，可提高轉化率。

3.如權利要求1所述的培養基，其特征在于配方：

將嗜醋酸棒桿菌在上述培養基中培養，吐溫80可改變肽聚糖層外棒狀霉菌酸的碳鏈長度和不飽和度，甘氨酸代替D-丙氨酸結合到嗜醋酸棒桿菌細胞壁上，削弱肽聚糖鏈間交聯，使得嗜醋酸棒桿菌細胞壁內外層結構均遭到破壞，不完整的細胞壁使得穿梭質粒能夠順利地穿越細胞障礙進入細胞。

4.如權利要求1所述的將嗜醋酸棒桿菌用氨芐青霉素進行前處理，其特征在于：用終濃度0.5-2ug/ml的氨芐青霉素處理30-150min，破壞嗜醋酸棒桿菌細胞壁結構，使菌體細胞壁形成小孔，抑制嗜醋酸棒桿菌細胞壁對穿梭載體的阻礙作用，使該穿梭質粒能夠通過電轉化方法有效地導入嗜醋酸棒桿菌中。

5.如權利要求1所述，在電擊時加入電擊緩沖液，電擊緩沖液配方：0.5M?KCl，0.15M?CaCl₂，0.25M?MgCl₂。K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺這幾種帶正電荷配體，均可與帶負電荷的細胞膜結合，從而促進細胞膜的擊穿，使得外源質粒更容易進入細胞內。

6.如權利要求1所述的將嗜醋酸棒桿菌電擊后熱激處理，其特征在于：感受態細胞電擊后立即加入0.5mlSOC培養基(2％(W/V)蛋白胨，0.5％(W/V)酵母抽提物，0.05％(W/V)氯化鈉，2.5mM氯化鉀，10mM氯化鎂，20mM葡萄糖)，混勻后轉移到1.5ml離心管后于46℃水浴6min，然后于30℃水浴1h，結束后離心濃縮菌體并涂布至含25μg/m1卡那霉素LB固體培養基中，熱激處理步驟可以使嗜醋酸棒桿菌的限制性系統暫時失活，穿梭質粒能順利地整合到嗜醋酸棒桿菌基因組上。