[發明專利]一種脫氮假單胞菌發酵生產維生素B12高產菌株的誘變方法

無效

• 申請號: 201110419220.4
• 申請日: 2011-12-15
• 公開（公告）號: CN102453690A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發明（設計）人: 任勇;冷曉紅;王友善;奇乃;董媛
• 申請（專利權）人: 寧夏多維藥業有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12R1/38
• 代理公司: 寧夏專利服務中心 64100
• 代理人: 徐淑芬

1.一種脫氮假單胞菌發酵生產維生素B₁₂高產菌株的誘變篩選方法，其特征是：以脫氮假單胞菌為出發菌株，將其菌懸液首先用甲磺酸乙酯進行化學誘變篩選后，再將選篩出來的菌株在低能離子注入機上進行低能離子注入誘變篩選獲得脫氮假單胞菌發酵生產維生素B₁₂高產菌株。

2.按照權利要求1所述的脫氮假單胞菌發酵生產維生素B₁₂高產菌株的誘變篩選方法，其特征在于所述的菌懸液采用如下方法獲得：取培養好的脫氮假單胞菌菌株新鮮斜面，用0.1mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液洗下菌體，裝入帶玻璃珠的三角瓶中振蕩2h，用磷酸緩沖液調節菌體數約為10⁷～10⁸個/ml。

3.按照權利要求1所述的脫氮假單胞菌發酵生產維生素B₁₂高產菌株的誘變篩選方法，其特征在于所述的化學誘變篩選過程為：

a.在菌懸液中加入0.05?mol/L甲磺酸乙酯，混勻后置于恒溫振蕩箱中振蕩50分鐘，隨后，立即加入0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液終止反應；同時另取菌懸液，不加甲磺酸乙酯作對照品；

b.用0.2mol/L、pH7.0～7.4磷酸鹽緩沖液將誘變后的菌懸液及對照品采用10倍倍比法分別稀釋至10^一4，然后分別吸取10^-2、10^一3、10^一4的菌懸液進行平板培養基培養，培養溫度?32℃，培養5～6天；

c.初篩：從平板培養基上挑選抗性突變株至斜面培養基，培養72h后將菌株接至種子培養基，培養24h，接至發酵搖瓶培養，培養168h后測VB₁₂的單位，選取VB₁₂含量高于對照品5％以上的高產菌株進行復篩；

d.復篩：將菌株從斜面接至種子培養基，24h后將10％的種子液接至搖瓶培養基，每株接3瓶，培養165～175h后測各菌株的維生素B₁₂的發酵單位，以此確定高產菌株。

4.按照權利要求1所述的脫氮假單胞菌發酵生產維生素B₁₂高產菌株的誘變篩選方法，其特征在于所述的離子注入誘變篩選的過程為：

A.從化學誘變獲得的高產菌株斜面培養基上刮取菌落接至種子培養基中，于35～37℃振蕩培養50h，再于6℃放置1h，使之同步生長，然后加0.5%酵母膏，繼續振蕩培養20～60min；培養液于2℃下3000r/min離心洗滌，收集菌體；移取適量菌體于盛0.85％的生理鹽水和玻璃珠的無菌三角瓶中，在300?r/min?的旋轉式搖床上振蕩10min，使其分散，過濾；通過細胞計數板計數，用生理鹽水將細胞懸液稀釋至10⁸個/ml備用；

B.離子注入誘變：

取上述0.5ml菌懸液均勻涂布于無菌培養皿中，無菌風制成菌膜后進行等離子體誘變；在低能離子注入機上進行，采用能量為10?keV，劑量分別為(1～9)×10¹⁴ions/cm²，采用脈沖式注入，每個脈沖為5s，間隔為30～50s，同時做對照樣品；

C.離子注入誘變后的樣品用無菌生理鹽水洗滌后進行10倍法稀釋，取?10^-4、10^-5、10^-63?個稀釋度涂布平板，32±1℃，50±5%相對濕度下培養6d，對長出的單菌落進行觀察計數；

D.菌株初篩

離子注入后，各處理組分別挑取140個單菌落，32±1℃，50±5%相對濕度下培養3d，然后挖塊接種進行搖瓶初篩；

E.菌株復篩

從初篩結果中選出效價高的突變株，經過反復多次復篩，選出前15%的突變株再進行復篩，復篩時，一株接三瓶平行樣，對挑選出的典型誘變菌株，逐一進行發酵搖瓶考察，選擇起步效價、放瓶發酵單位和OD值均較高的菌種。

5.按照權利要求2、3或4所述的脫氮假單胞菌發酵生產維生素B₁₂高產菌株的誘變篩選方法，其特征在于上述斜面培養的培養基配方為：50％甜菜糖蜜140g、硫酸銨?0.45g、硫酸鎂3.1g、硫酸錳0.2g、硫酸鋅0.2g、磷酸氫二銨2.35g、瓊脂28g，投料配比g/1000ml。