[發明專利]一種人工假病毒的制備方法

在審

• 申請號: 201110417123.1
• 申請日: 2011-12-14
• 公開（公告）號: CN102517257A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 李琳;曹健榮;張誌
• 申請（專利權）人: 北京金豪制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/70;C12R1/19;C12R1/93
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所 11130
• 代理人: 王為

1.一種人工假病毒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，核酸提取

步驟2，PCR擴增

步驟3，凝膠回收PCR片段

步驟4，限制性酶消化片段、載體

步驟5，凝膠回收酶切產物

步驟6，連接反應

步驟7，轉化連接產物

步驟8，質粒提取

步驟9，酶切篩選連接陽性

步驟10，誘導提取人工假病毒。

2.根據權利要求1的制備方法，其特征在于，其中

步驟1核酸提取，步驟如下：

1)樣本裂解及核酸吸附：

在1.5ml無核酸酶的離心管中加入10μl助沉劑和400μl裂解液，加入200μl待病毒培養物，劇烈震蕩2分鐘，室溫靜置10分鐘；

加入480μl無水乙醇，顛倒混勻，吸取600μl裂解混合物轉移到核酸吸附柱中；

3500g離心2分鐘，取下套管，倒掉套管中的液體，將剩余裂解混合物轉移至核酸吸附柱，重新離心一次，棄套管中的液體；

將核酸吸附柱重新裝入套管，6000g離心1分鐘，倒掉套管中的液體；

其中，所述病毒培養物為腸道病毒各亞型病毒培養物；其來源如下：病毒培養物由國家CDC病毒病所提供，采用常用的雞胚培養法，

如病毒培養物體積小于或大于200μl，需按比例改變助沉劑、裂解液以及無水乙醇體積，體積大于400μl樣本應分多次進行處理；有關試劑的準備如下：

分別在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml無水乙醇，顛倒充分混勻，并在瓶身上加以標識；

吸取所需的洗脫液，加至一無核酸酶的eppendorf管中，于70℃預熱；

冷凍樣本應室溫融化，輕微震蕩混勻后使用；

助沉劑在低溫保存時可能呈膠狀，吹打混勻即可使用，

2)核酸純化：

將核酸吸附柱重新裝入套管，在核酸吸附柱中加入500μl洗液A，6000g離心1分鐘，將核酸吸附柱裝入一個干凈套管中；

在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，靜置1分鐘，6000g離心1分鐘；

倒掉套管中的液體，將核酸吸附柱重新裝入套管；

在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，6000g離心1分鐘；

將核酸吸附柱換一新套管，13000rpm離心3分鐘，

3)核酸洗脫：

將核酸吸附柱裝入一無核酸酶1.5ml離心管，小心在吸附膜中央加入50μl預熱洗脫液，室溫靜置4分鐘；

10000rpm離心2分鐘，離心管中液體即樣本RNA，該樣本RNA作為下一步擴增的模板。

3.根據權利要求1的制備方法，其特征在于，其中

步驟2.PCR擴增，步驟如下：

1)反應體系：

在0.2mlPCR管中依次加入2*PCR?buffer?12.5ul，DNA聚合酶1ul，逆轉錄酶0.35ul，上游引物0.2uM，下游引物0.2uM，模板RNA?5ul，補水至總體積25ul，充分震蕩混勻，放入PCR儀中，進行PCR擴增；

2)擴增程序

4.根據權利要求1的制備方法，其特征在于，其中

步驟3.凝膠回收PCR片段，步驟如下：

配置2％瓊脂糖凝膠，室溫凝固至少30min；

將PCR管中樣品加loading?buffer后上樣，電泳；

切膠回收；

切膠，盡可能去除多余膠塊，稱重，按1∶3體積加入溶膠液PN，50℃水浴放置10min，其間多次翻轉離心管，以確保凝膠徹底溶解；

柱平衡：吸附柱中加入500uL平衡液BL，12000rpm，1min，棄廢液；

將融好的膠液加入吸附柱中，室溫靜置2分鐘，12000rpm，30-60s，棄廢液

向吸附柱中加入600uL漂洗液PW，12000rpm，30-60s，棄廢液；

向吸附柱中加入600uL漂洗液PW，12000rpm，30-60s，棄廢液；

吸附柱再離心2min，12000rpm，徹底去除漂洗液，室溫開蓋放置幾分鐘，以利于乙醇揮發；

吸附柱重新置入一干凈dorf管中，向吸附柱膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫靜置2分鐘，12000rmp離心2分鐘收集DNA溶液，產物保存于-20℃。