[發明專利]一種草酸青霉菌發酵液的制備工藝及其在農業中的應用

有效

• 申請號: 201110416872.2
• 申請日: 2011-12-14
• 公開（公告）號: CN103160441A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 劉文菊;耿麗平;陸秀君;趙全利;張麗娟
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;A01B79/02;C05F11/08;C12R1/80
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于微生物和土壤肥料技術領域，具體涉及一種加速玉米秸稈腐解青霉屬菌株的獲得及其發酵液的制備工藝，本發明還涉及該發酵液在農業生產中的應用方法。

技術背景

??秸稈還田是當今世界上普遍關注的一項農藝措施，在減少了秸稈焚燒所造成的大氣污染的同時還有增肥增產作用，但若方法不當，也會導致土壤病菌增加，作物病害加重及缺苗（僵苗）等不良現象。目前秸稈還田技術主要有三種：一是直接粉碎還田，二是堆肥后還田，三是過腹還田（喂飼牲畜后糞便還田）。而直接粉碎由于節省人力物力最容易推廣，但目前的情況是，秸稈粉碎直接還田后腐解時間較長，腐解前期土壤過于松透，大孔隙過多，導致跑風，播種后土壤與種子不能緊密接觸，影響種子發芽生長，特別是在玉米-小麥輪作區，玉米秸稈粉碎于田間并耕翻后，由于腐解時間較長等原因，常常造成小麥播種后不能發芽或者吊根死苗，到冬季又易造成小麥凍害，從而影響小麥高產穩產；再者，由于秸稈長時間不能腐解，致使一些害蟲和病原菌在土壤中長時間存活，給作物生產又帶來潛在危害。因此，目前急需一種促進秸稈快速腐解的方法。

發明內容

1.技術問題

本發明提供一種優化的以玉米秸稈為主要原料，以草酸青霉菌（保藏號為CGMCC?No.4842）為種子菌的發酵液的制備工藝，同時提供一種其發酵液促進玉米秸稈腐解的方法。

2.技術方案???

（1）具有能分解纖維素能力的菌株的分離

稱取土壤樣品10?g于裝有100?mL富集培養基（羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5?g，NaNO₃?1?g，KCl?0.5?g，Na₂HPO₄·12H₂O?0.7?g，KH₂PO₄?0.9?g，MgSO₄·7H₂O?0.5?g，酵母膏0.5?g，水解酪素0.5?g，蒸餾水定容到1000?mL?，pH為7）的錐形瓶中，在28℃下振蕩培養3～4?d。從富集培養基土壤液中吸取100?μl土壤懸液加入盛有900?μl無菌水的離心管中充分混勻，采用逐級稀釋法將菌懸液稀釋至合適濃度，用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)鑒別培養基（CMC-Na?5?g?,酵母膏1.?0?g，?KH₂PO_4?0.25g,?(NH_4?)?₂?SO₄?0.4?g，?MgSO₄?·7H₂O?0.01?g?，蛋白胨?0.1?g，瓊脂粉15?g?，土豆汁100?mL，蒸餾水定容到1000?mL，pH為7）平板涂板培養，每土樣重復3次，28℃培養至菌落長出，挑取出現明顯透明圈的菌落，分別編號并記錄培養性狀，純化培養和保存。

（2）分解纖維素的高效菌株篩選

在上述方法篩選菌株的基礎上，采用Hart?T?D（Hart?T?D，2002，World?Journal?of?Microbiology?and?Biotechnology，18:471-480）的水解圈測定法進一步篩選高效菌株。將獲得的菌株分別轉接于羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)鑒別培養基平板上培養96?h，然后用剛果紅(10?mg/mL)染色培養好的平板，染色30?min后，倒出染液，再用NaCl洗滌15?min后倒出溶液，每菌株重復4次，測量水解圈直徑，選取水解圈最大的一個菌落，PDA培養基純培養。

（3）青霉屬菌的鑒定

菌株形態鑒定：將上述純培養獲得的菌落，在羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)鑒別培養基上進行菌落形態觀察和顯微鏡鏡檢。該菌株在羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)鑒別培養基培養后，菌落起初灰綠色，均勻分布在培養基表面，呈輪紋狀，邊緣無色半透明，菌落背面淺青綠色。在顯微鏡下可以看出菌絲無色，分生孢子梗散生，從菌絲垂直生出，分生孢子梗長柱狀，分生孢子梗下部不分支；有橫隔膜，分生孢子梗頂端生排列成帚狀的間枝，間枝頂層為小梗，小梗具瓶梗3個，頂生呈串不分枝的鏈狀分生孢子，分生孢子光滑近圓形，藍綠色。根據《真菌鑒定手冊》鑒定為半知菌亞門(Deuteromyeotina)、絲孢綱(Hypholnseetes)、絲孢目(Moniliales)、叢梗孢科(Moniliaceae)、青霉屬（Penicillium）菌株。