[發明專利]一種人氣道上皮細胞的培養方法

無效

• 申請號: 201110416809.9
• 申請日: 2011-12-13
• 公開（公告）號: CN102433296A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 盧文菊;何建行;王健;鐘南山;張晨婷;徐小明;陳豫欽;鞏雪芳
• 申請（專利權）人: 廣州醫學院第一附屬醫院;呼吸疾病國家重點實驗室
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;馬赟齋

技術領域

本發明是一種人氣道上皮細胞的培養方法，屬于生物技術領域。

背景技術

氣管或支氣管是下呼吸道的重要組成部分，氣道上皮細胞是呼吸道的重要防御屏障，已有研究發現，反復的呼吸道感染與粘膜上皮功能失調密切相關，因此，氣道上皮細胞是探尋COPD、哮喘等呼吸系統常見疾病發病機制的重要研究材料。氣道上皮細胞離體后，生物學特性尚未發生變化，能在一定程度上反映體內狀態，并顯示親體組織的形態學特征和細胞生物學特性，因此體外氣道上皮細胞的原代培養和細胞株的建立是研究親體組織生物學特性的有效手段，同時也為研究呼吸道疾病發病機制及其防治措施提供研究工具。另外，我國的氣管移植技術一直處于實驗研究階段，組織工程氣管是氣管移植的重要手段，而氣道上皮細胞作為種子細胞是組織工程氣管中不可缺少的部分，因此找到一種簡便、高效的氣道上皮培養方法對研究呼吸系統疾病發病機制以及開展氣管移植都具有重要的意義。

目前，氣道上皮細胞的培養方法主要有：胰酶和/或蛋白酶消化結合機械剝離粘膜法和/或機械刮刷法，這些方法都存在以下缺點：(1)機械剝離粘膜法/機械刮刷法是采用鑷子等器械在氣管或支氣管上進行鈍性分離，其操作難度大，且在剝離過程中容易損傷上皮細胞，獲得的存活細胞少，且細胞活力差。(2)胰酶消化/蛋白酶消化法是采用胰酶/蛋白酶溶液對氣管或支氣管進行消化處理，以獲得上皮細胞，但是胰酶/蛋白酶的消化力很強，且消化時間不易掌握，易對上皮細胞造成損失，細胞獲得率少，細胞存活率低且活力差。另外，尚存在以下原因導致以人氣道上皮細胞為來源的細胞培養受到限制：1.肺臟為一開放性臟器，因此獲得的氣道在進行細胞培養的過程中易發生污染，同時由于患者氣道含有大量粘蛋白等渣滓而增加了細胞分離的難度；2.可用于分離氣道上皮細胞的標本，都是從手術切除下來的具病灶的部位，標本數量有限，且標本中的正常的氣管或支氣管很少，如采用一般的氣道上皮細胞培養方法，對細胞損傷大、獲得率低再加上細胞貼附能力差，最后成活的細胞數量極少；3.氣道上皮細胞原代培養中，最容易引進成纖維細胞污染，成纖維細胞生長快、活力好，具有生長優勢，最終造成原代氣道上皮細胞培養失敗。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效、簡便、高純度的人氣道上皮細胞的培養方法。

本發明的目的通過以下技術方案實現：一種人氣道上皮細胞的培養方法，包括以下步驟：

(1)獲取原代培養的人氣道上皮細胞：取離體人氣管或支氣管，用消化培養基在4℃消化24～48h后收集氣道上皮細胞，然后接種至培養皿中，用完全培養基進行原代細胞培養，獲得原代培養的人氣道上皮細胞；

(2)獲取傳代培養的人氣道上皮細胞：

當原代細胞達到70～90％融合密度后，用磷酸緩沖液(PBS)溶液清洗，加入0.25％胰蛋白酶溶液，室溫消化5～10分鐘，當細胞出現回縮、懸浮時，收集細胞懸浮液，加入含有蛋白酶抑制劑的等量溶液，離心收集細胞，然后以1～6×10⁶細胞/ml的濃度接種于新的含完全培養基的培養皿中進行培養，3～5天細胞生長至對數生長期，獲得傳代培養的人氣道上皮細胞。

所述步驟(2)中胰蛋白酶溶液中含0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)；在培養皿中，每100mm單孔板的胰蛋白酶溶液的用量為1ml。

所述步驟(2)中蛋白酶抑制劑為大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean?Trypsin?Inhibitor)，濃度為0.5～1mg/ml。

所述步驟(1)中獲取原代培養人氣道上皮細胞的具體步驟為：

1>在顯微鏡下分離棄除氣管或支氣管上所有額外的結締組織，然后切成小段組織塊，用預冷的生理鹽水清洗，將分離干凈的氣管或支氣管浸泡在浸泡培養基中，渦旋震蕩30～60s后，浸泡5～10min，接著用洗滌培養基沖洗干凈，把洗好的組織塊置于離心管內，加入消化培養基，4℃，在搖床上以轉速50～60r/min消化氣管或支氣管組織塊24～48h；

2>取出經消化的氣管或支氣管組織塊倒入培養皿中，加入胎牛血清至終體積濃度為10～20％，縱向剪開氣管，用細胞刷輕刮內表面，然后用磷酸緩沖液沖洗內表面和細胞刷，收集含有脫落細胞的溶液，4℃離心5min后，用洗滌培養基清洗細胞，4℃離心5min后，用完全培養基重懸細胞；

3>用完全培養基調整細胞密度，以1～6×10⁵細胞/ml的密度接種于培養板中，于37℃、5％CO₂培養箱內靜置培養2～3天，得到原代培養的人氣道上皮細胞。