[發明專利]用于表達miRNA和/或蛋白的載體及其應用

有效

• 申請號: 201110416641.1
• 申請日: 2011-12-14
• 公開（公告）號: CN102517313A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 盛望;陳學斌;楊志平;曾毅;李澤琳
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種用于表達miRNA和/或蛋白的表達載體及其應用。

背景技術

miRNA是真核生物中一類長度約為22核苷酸，參與基因轉錄后水平調控的非編碼小分子RNA，成熟的miRNA是由較長的可折疊形成發卡結構的前體轉錄物經過Dicer酶或類似于Dicer酶的內切核酸酶加工而來。miRNA基因存在于基因組的間隔區域或者內含子當中。這些小分子的RNA通過堿基配對與靶mRNA序列的3’UTR區結合來調控基因的表達。目前人們對miRNA的生物合成過程已經了解比較清楚，細胞內編碼的miRNA的基因首先在RNA聚合酶II的作用下發生轉錄，形成長度約為幾百個核苷酸的初級轉錄產物pri-miRNA，初級轉錄產物在RNaseIII家族酶-Drosha的參與下被加工成只含60-70nt具有莖環結構的單個miRNA前體pre-miRNA；在另一個RNaseIII家族酶-Dicer的參與下，miRNA前體被加工為雙鏈的miRNA，隨后接連形成單鏈成熟的miRNA。miRNA的轉錄所需的轉錄酶與蛋白表達所需的轉錄酶都屬于RNA聚合酶II，因此可以使用同一個II型轉錄啟動子。

目前較為常用的miRNA表達載體一般是在利用某一特定的miRNA基因的5’-flanking?region和3’-flanking?region作為克隆位點來連接體外合成發卡形狀的miRNA的前體。由于miRNA在基因組中的位置的特殊性，決定了在體外情況下，普通的miRNA表達載體中無法插入外源蛋白進行表達。這就限制了載體的用途。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于表達miRNA和/或蛋白的表達載體。

本發明所提供的表達載體是由線性載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR和兩端各有一個粘性末端的雙鏈DNA片段連接而成的環狀表達載體；所述線性載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的兩個末端和所述雙鏈DNA片段的兩個粘性末端相連，并且兩個連接處均形成限制性內切酶BsmB?I的識別位點。限制性內切酶BsmB?I的識別位點及酶切位點為：

??????????????3’-......GCAGAG(N)_5▲......-5’

上述序列中帶下劃線部分為限制性內切酶BsmB?I的識別位點，三角形代表酶切位點。BsmB?I切出的位點有四個堿基的粘性末端，這幾個堿基是隨機的堿基，沒有序列特異性，因此可用BsmB?I切出pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR粘性末端的四個堿基，這樣就不會破壞pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體自身攜帶的flanking?region的核苷酸序列也就不會影響miRNA的表達，因此發明人設計使所述兩個連接處均形成限制性內切酶BsmB?I的識別位點。

實際操作中，可在所述雙鏈DNA片段的內部添加限制性內切酶Dra?I的識別位點。關于Dra?I的設計，在圖1中可以看出在5’側翼序列(5’-flanking?region)的前端有EmGFP的序列，此序列前后都有Dra?I酶切位點，在此序列的后面有終止密碼子(后一個Dra?I后，5’-flanking?region前面，miRNA的表達不受影響)，因此，此線性的末端不能直接連接蛋白表達。在試驗中，本發明人在插入的多克隆位點中間加入一個Dra?I酶。加上插入的Dra?I，該質粒中共有三個Dra?I位點，用Dra?I酶切正好切除EmGFP和5’-flanking?region的區域，而不破壞EmGFP前面的啟動子，因此蛋白可以正常表達。

所述DNA片段的一條鏈為如下a)-c)中：

a)其核苷酸序列為序列表中序列2；

b)其核苷酸序列為在序列表中序列2的第11位和第12位核苷酸之間再插入1-50個脫氧核糖核苷酸后所組成的序列；所述1-50個脫氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互補序列：5′-CGTCTC-3′；

c)其核苷酸序列為序列表中序列4；

所述DNA片段的另一條鏈為如下d)-f)中的任一種：

d)其核苷酸序列為序列表中序列3；

e)其核苷酸序列為在序列表中序列3的第11位和第12位核苷酸之間再插入1-50個脫氧核糖核苷酸后所組成的序列；所述1-50個脫氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互補序列：5′-CGTCTC-3′；