[發明專利]一種突變腈水合酶

有效

• 申請號: 201110415465.X
• 申請日: 2011-12-13
• 公開（公告）號: CN102517271A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 于慧敏;劉杰;劉昌春;陳杰;沈忠耀
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/63;C12N1/21;C12P13/02;C12R1/19;C12R1/365;C12R1/15;C12R1/01
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 史雙元

技術領域

本發明屬于酶工程和工業微生物技術領域，具體涉及一種耐熱和超聲耐受性突變腈水合酶、該酶的構建方法及其在微生物法生產丙烯酰胺中的應用。

背景技術

微生物生產的腈水合酶，可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺。丙烯酰胺聚合產生的聚丙烯酰胺在三次采油、水處理、造紙等工業生產領域具有非常廣泛的應用。利用微生物產生的腈水合酶催化生產丙烯酰胺具有一系列優點，包括反應在常溫常壓下進行、能耗低、操作簡單、安全、丙烯腈轉化率高、產物濃度和純度高等，因此逐漸成為丙烯酰胺生產的主要方法。

微生物法生產丙烯酰胺的研究重點在于高產腈水合酶菌株的發現和改造以及對腈水合酶本身性能的基因工程改造。其中，在基因工程方面，日本三菱化成株式會社對來自根瘤菌屬的腈水合酶基因和蛋白申請了專利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和編碼該蛋白的基因》(申請號：93106122.9)；三井化學株式會社對來自嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及編碼它的基因申請了專利《參與活化腈水合酶的蛋白以及編碼它的基因》(專利號：ZL99106291.4)；《新型腈水合酶》(專利號：02156180.X)，并研究了該基因在重組大腸桿菌中的表達；德國底古薩股份公司申請了《紅球菌屬的腈水合酶》(申請號：200580008206.8)；清華大學公開了“一種腈水合酶及其編碼基因與應用”，構建了α亞基起始密碼子突變的腈水合酶，并在大腸桿菌中高活性表達(專利號：ZL?200410042576.0)；清華大學在專利“一種腈水合酶基因簇及其應用”中公開了赤(紅色)紅球菌Rhodococcus?ruber?TH中與腈水合酶高表達相關的結構基因和調控基因序列(中國專利申請號：200910076710.1)。

除了產物/底物耐受性外，在微生物法生產丙烯酰胺的催化水合過程中，制約生產效率的另一個主要問題就是產酶細胞的耐熱性較差，水合溫度必須通過低溫制冷劑控制在15-22℃。由于腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺是強放熱反應，工業生產中控溫的冷量經常供應不足，導致水合溫度波動到25℃以上。較高的水合溫度一方面會加快反應速率，提高生產效率，另一方面則會造成腈水合酶的快速失活，減少反應批次，增加生產成本。日本三菱麗陽株式會社公開了專利《改良型腈水合酶》(公開號：CN?1961072A)，對腈水合酶β亞基第93位、第167位和219位氨基酸殘基進行定點突變，提高了腈水合酶的熱穩定性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種突變腈水合酶及其突變基因。

本發明的目的還在于提供含有上述腈水合酶突變基因的轉化體。

本發明的目的還在于提供突變腈水合酶在制備丙烯酰胺中的應用。

一種突變腈水合酶，該突變腈水合酶的獲得方法是對具有SEQ?ID?NO：1所示氨基酸序列的腈水合酶中氨基酸殘基的至少一個殘基進行置換和添加；所述置換的殘基對應于SEQ?ID?NO：1所示氨基酸序列的141位Ser、143位Ser、144位Leu；所述添加的殘基位于SEQ?ID?NO：1所示氨基酸序列的末端殘基之后，添加個數為1-2個。

所述氨基酸殘基的置換包括將對應于SEQ?ID?NO：1氨基酸序列中141位的Ser殘基置換為Lys，將對應于143位的Ser殘基置換為Lys，將對應于144位的Leu殘基置換為Glu；所述氨基酸殘基的添加包括在SEQ?ID?NO：1氨基酸序列的末端添加的Asp和Thr。

上述突變腈水合酶的基因，或含有該基因的表達載體。

所述突變基因或含有該基因表達載體的轉化體。

所述轉化體為大腸桿菌、諾卡氏菌、紅球菌或丙酸棒桿菌。

上述改良腈水合酶轉化體的構建方法，可采用氯化鈣法或電穿孔轉化法(Sambrook?J等.Molecular?Cloning：A?Laboratory?manual.Cold?Spring?Harbor，NY：Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press.1989)將載體導入受體菌。也可以將改良腈水合酶基因直接插入轉化體的染色體。

上述突變腈水合酶在制備丙烯酰胺中的應用。

本發明所述改良腈水合酶轉化體的游離細胞可直接用于從丙烯腈水合制備丙烯酰胺。