[發明專利]一種鹽酸克倫特羅檢測試劑盒及其制備和使用方法

有效

• 申請號: 201110414539.8
• 申請日: 2011-12-13
• 公開（公告）號: CN102520155A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 楊致亭;孫明強;陶德友;管廷武;劉發新
• 申請（專利權）人: 濰坊市康華生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531;G01N33/535
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 李江

技術領域

本發明涉及一種鹽酸克倫特羅檢測試劑盒及其制備和使用方法，具體地說是一種采用直接競爭化學發光免疫方法檢測鹽酸克倫特羅的試劑盒及其制備和使用方法，屬于瘦肉精檢測領域。

背景技術

鹽酸克倫特羅（elenbuterol?hydroehloride，簡稱CL）是一種β₂-腎上腺素受體激動劑，商品名為氨哮素、克喘素，是兒茶酚胺的一種衍生物，俗稱“瘦肉精”。將一定量的CL添加到飼料中，能明顯促進動物生長率和飼料轉化率，促進動物脂肪分解，瘦肉率提高10%左右。隨著CL在畜牧生產中的應用，人們發現CL能在動物體內蓄積殘留，導致食用中毒。CL中毒會對人的身體健康造成嚴重的危害，其癥狀包括：血壓升高、血管擴張、心跳加快、呼吸加劇、體溫升高、肌肉顫抖、頭痛、胸悶、神經過敏、肌肉疼痛、心悸、惡心、嘔吐等。由于CL作為飼料添加劑的危害嚴重，上世紀90年代，歐洲等國家紛紛頒布法規，嚴禁將CL用作促生長劑。我國農業部在1997年3月（農牧發[1997]?3號文）嚴令禁止腎上腺素在動物生產中的應用，但目前國內非法濫用的情況依然嚴重。

目前檢測CL的方法主要有HPLC-MS（高效液相色譜-質譜）、GC-MS（氣相色譜-質譜）和ELISA（酶聯免疫吸附法）法。HPLC-MS和GC-MS兩種方法所需的設備昂貴、操作復雜，通常作為定量和確證方法；ELISA方法操作簡單、快速，但其靈敏度低，適用于定性和半定量，通常用作大規模樣品篩選。

化學發光免疫分析法（chemilumi-nescence?immunoassay，CLIA）是將免疫反應和化學發光反應相結合以檢測抗原或抗體的免疫技術，它以化學發光物質或酶為標記物，直接標記在抗原或抗體上，免疫反應結束后，加入發光底物。利用發光信號檢測儀測量發光強度，根據化學發光標記物與發光強度的關系計算出被測物的含量(?Shelver等，2002)。它同時具有化學發光法的高靈敏度和免疫分析法的成本低、速度快、特異性強、樣品與處理簡單和選擇性強等優點，非常適合快速檢測。

目前化學發光酶免疫分析技術在環境監測、食品安全、制藥和臨床醫學等領域有較大發展。前人采用間接競爭化學發光酶免疫分析法對豬尿樣中的CL進行檢測，檢測靈敏度分別為0.08μg/L和0.01μg/L，但方法只限于豬尿樣中CL的測定；有些采用間接競爭化學發光酶免疫法測定沙丁胺醇和CL，但操作繁瑣耗時。

發明內容

為了解決上述問題，本發明設計了鹽酸克倫特羅檢測試劑盒及其制備和使用方法，該試劑盒能夠對鹽酸克倫特羅進行快速檢測，且結果準確，誤差小，檢測靈敏度高，對檢測設備要求低。

本發明的技術方案為：

一種鹽酸克倫特羅檢測試劑盒，包括盒體、設在盒體內的鹽酸克倫特羅酶標板，以及鹽酸克倫特羅標準溶液、鹽酸克倫特羅酶結合物、稀釋液、濃縮洗滌液、第一底物和第二底物；

所述酶標板的板孔包被有固相化的鹽酸克倫特羅抗體；

所述鹽酸克倫特羅標準溶液包括濃度依次為：0?ng/ml、0.1?ng/ml、0.3?ng/ml、0.9?ng/ml、2.7?ng/ml、8.1?ng/ml的鹽酸克倫特羅溶液；

所述鹽酸克倫特羅酶結合物，為辣根過氧化物酶標記的鹽酸克倫特羅抗原；

所述稀釋液為pH=7.0的0.01M?的磷酸鹽緩沖溶液；

所述濃縮洗滌液為含有體積分數0.05%的吐溫-20、PH=7.5濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液；

所述第一底物為每250ml含有BSA?2.5g、Tris1.5g、魯米諾0.05g、對位碘酚0.0075g，pH=9.0的溶液；

所述第二底物為每250ml含有BSA?2.5g、Tris1.5g、過氧化氫0.25ml，pH=9.0的溶液。

上述鹽酸克倫特羅檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

（1）鹽酸克倫特羅酶標板的制備

1.1包被液的配制：稀釋配制2μg/ml的鹽酸克倫特羅抗體溶液；

1.2包被量：將酶標板的板孔加入上述制備的包被液100μl，4℃包被48小時；

1.3洗滌：將上述包被后的酶標板用濃縮洗滌液洗滌兩次；

1.4封閉：將上述洗滌后的酶標板板孔每孔加封閉液130μl，室溫20-25℃封閉3小時；

1.5干燥：將上述封閉后的酶標板板孔中的封閉液甩出，然后18-25℃干燥48小時；

1.6將上述干燥后的酶標板裝入鋁箔袋，封口，備用。

（2）鹽酸克倫特羅標準溶液的配制