[發(fā)明專利]一種采用定向交叉偶聯(lián)技術(shù)制備的短肽抗體試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110414525.6
• 申請日: 2011-12-10
• 公開（公告）號(hào): CN103163302A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉超;王紅權(quán);葛蘭;黃麗晶;趙婧;閆少峰;許曉紅
• 申請（專利權(quán)）人: 石家莊恩澤藥品技術(shù)開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗體檢驗(yàn)試劑盒，特別涉及短肽抗體ELISA檢驗(yàn)試劑盒。?

背景技術(shù)

研究表明，II型膠原(CII)是與RA發(fā)病相關(guān)的主要自身抗原之一。抗類風(fēng)濕肽(NTAP)作為一種基于CII主要抗原結(jié)合位點(diǎn)(263-272序列)的變構(gòu)肽，將原型肽中與TCR結(jié)合的氨基酸殘基替換，保留與HLA-DRβ1結(jié)合的氨基酸，從而能夠競爭性地抑制自身致病抗原與HLA-DRβ1分子的結(jié)合，卻不被TCR識(shí)別，特異性地阻斷抗原肽-HLA-TCR復(fù)合物的形成，從發(fā)病上游阻斷RA病理免疫應(yīng)答，達(dá)到治療RA的目的。NTAP作為RA治療的潛力藥物，具有很高的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。?

作為一種多肽，NTAP在體內(nèi)可能會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。NTAP抗體的檢驗(yàn)對于評(píng)價(jià)NTAP的安全性和藥效均有很大的作用，是NTAP開發(fā)成藥品的安全性檢驗(yàn)的必檢之項(xiàng)。作為創(chuàng)新藥物，NTAP沒有現(xiàn)成可用的抗體檢測方法，因此開發(fā)一種靈敏、可信的NTAP抗體檢驗(yàn)方法，勢在必行。?

夾心法和直接法是制備ELISA檢測試劑盒的常規(guī)方法，由于NTAP是僅由十個(gè)氨基酸組成的短肽，采用常規(guī)方法制備短肽抗體的ELISA檢測試劑盒非常困難。?

夾心法：即雙抗體夾心法，利用連接于固相載體上的抗體結(jié)合抗原，實(shí)現(xiàn)血清中抗原特異性抗體的檢測，由于NTAP屬于短肽，沒有過多的抗原決定簇或可結(jié)合區(qū)域，因此該方法不易實(shí)現(xiàn)。?

直接法：即直接將抗原吸附在載體表面上的方法，而由于NTAP分子量太小，直接包被在固相載體上的效果不好，所得酶標(biāo)板的檢測效果均一性差，檢測結(jié)果的重現(xiàn)性不佳。?

同時(shí)，由于短肽不具有或僅有較低免疫原性，短肽陽性對照抗體不易獲得?，F(xiàn)有技術(shù)通常使用偶聯(lián)載體蛋白的方法制備短肽抗體，但是試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NTAP直接偶聯(lián)載體蛋白無法獲得滿足檢測的高效價(jià)的抗體。?

NTAP僅由10個(gè)氨基酸組成，在體內(nèi)較難形成抗體，且由于其屬于短肽，因此沒有過多的抗原決定簇或可結(jié)合區(qū)域，因此用傳統(tǒng)的陽性抗體制備的方法不能獲得滿足檢測的高效價(jià)陽性對照抗體、亦無法用常規(guī)的夾心法或直接法制備包被板及得到檢驗(yàn)試劑盒。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在用酶聯(lián)免疫的方法結(jié)合NTAP的特點(diǎn)，采用定向交叉的偶聯(lián)方法，開發(fā)出一種能簡單、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)血清中NTAP抗體的檢驗(yàn)方法，以求解決NTAP抗體檢驗(yàn)的難題。?

本發(fā)明提供了一種用于NTAP抗體檢測的酶標(biāo)板，是包被有NTAP的酶標(biāo)板。包被有NTAP的酶標(biāo)板，NTAP的C端連接半胱氨酸(Cys)，再在半胱氨酸上連接載體蛋白。其載體蛋白選用牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血藍(lán)蛋白(KLH)等大分子白蛋白，優(yōu)選為牛血清蛋白(BSA)。所述偶聯(lián)方法為常規(guī)方法，如DDC法(二環(huán)己基碳二亞胺法)，EDC法(對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺法)，戊二?醛法或N-琥珀酰亞胺法，其中優(yōu)選EDC法。用于包被抗原的固相載體物質(zhì)為常規(guī)物質(zhì)，可以為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。載體的形式為常規(guī)形式，可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠或小圓片等。?

本發(fā)明還提供了一種NTAP抗體ELISA檢驗(yàn)試劑盒。本發(fā)明的NTAP抗體檢驗(yàn)試劑盒包括包被有NTAP的酶標(biāo)板，純化抗體，酶和二抗。?

所述包被有多肽藥物NTAP的酶標(biāo)板，是包被有抗原的固相載體，根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合原理檢測受試者體內(nèi)是否有抗體產(chǎn)生。所述包被有NTAP的酶標(biāo)板，NTAP的C端連接半胱氨酸(Cys)，定向偶聯(lián)于載體蛋白，其載體蛋白選用牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血藍(lán)蛋白(KLH)等大分子白蛋白，優(yōu)選為牛血清蛋白(BSA)；所述偶聯(lián)方法為常規(guī)方法，如DDC法(二環(huán)己基碳二亞胺法)，EDC法(對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺法)，戊二醛法或N-琥珀酰亞胺法，其中優(yōu)選EDC法；用于包被抗原的固相載體物質(zhì)為常規(guī)物質(zhì)，可以為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式為常規(guī)形式，可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠或小圓片等。?