[發明專利]利用葡萄糖產丁二酸的基因工程菌株及其發酵產酸方法

無效

• 申請號: 201110413137.6
• 申請日: 2011-12-13
• 公開（公告）號: CN102533626A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 姜岷;梁麗亞;劉嶸明;茍冬梅;張常青;馬江鋒;陳可泉;韋萍;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/09;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 樊文紅

1.一株產丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌?BA205（Escherichia?coli?BA205），其保藏登記號為CCTCC?M?2011447。

2.權利要求1所述的大腸埃希氏菌?BA205的構建方法，其特征在于其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大腸桿菌為出發菌株，利用同源重組技術敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶后，得到能夠高效利用葡萄糖生長并產丁二酸大腸埃希氏菌?BA205。

3.根據權利要求1所述的大腸埃希氏菌?BA205的構建方法，其特征在于具體構建步驟如下：

（1）以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的E.coli?NZN111菌株為出發菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同時缺乏ldhA、pflB和PPC的感受態菌株；

（2）合成一對5’端帶有酶切位點的引物，以Bacillus?subtilis基因組DNA為模板，純化擴增出的pck基因后，表達質粒pTrc99a用與引物所設計的酶切位點一致的酶雙酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-pck；?

（3）合成一對5’端帶有相同酶切位點的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴增出的pncB基因后，已構建的重組質粒pTrc99a-pck用與引物所設計的酶切位點一致的酶單酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-pck-pncB；?

（4）將重組質粒pTrc99a-pck-pncB導入步驟（1）得到的感受態菌株，獲得陽性轉化子；

（5）利用步驟（4）的陽性轉化子過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶，恢復其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到高效利用葡萄糖代謝產丁二酸基因工程菌大腸埃希氏菌?BA205。

4.利用權利要求1所述的大腸埃希氏菌?BA205發酵生產丁二酸的方法，其特征在于采用兩階段發酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發酵產酸。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于將大腸埃希氏菌?BA205按1%(v/v)接種量接種入有氧階段發酵培養基中有氧培養，當有氧培養菌體OD₆₀₀至0.4～0.6用0.3?mM的IPTG誘導至OD₆₀₀=3時，按接種量10%轉接至厭氧階段發酵培養基中厭氧發酵。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述的厭氧階段發酵培養基是以葡萄糖為碳源的產丁二酸大腸桿菌用發酵培養基。