[發明專利]一種通過誘變提高紅霉素生產菌對正丙醇的耐受性的方法

無效

• 申請號: 201110411022.3
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN103160446A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 張麗麗;于新令;程傳東;李瑾;何海燕;王鳳灘
• 申請（專利權）人: 山東方明藥業集團股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12N13/00;C12R1/465
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技術領域

本發明涉及一種生物工程領域、特別涉及一種通過微生物誘變手段提高紅霉素產量的方法。

背景技術

紅霉素屬大環內酯類抗生素，具有廣譜抗菌作用。對G⁺菌有強大抗菌作用，尤其對耐青霉素的金葡菌有效。對立克次體、支原體、螺旋體有較強的抑制作用。對阿米巴原蟲、滴蟲也有抑制作用。

紅霉素是從紅霉素鏈霉菌的培養液中分離出來的一種堿性抗生素，后來從發酵液中分離出來紅霉素A、B、C、D、E等組分，其中以紅霉素A為主要組分，抗菌活性強、且毒副作用較??；其它組分抗菌活性弱，而毒副作用又較A大。通常所稱的紅霉素即指紅霉素A及其鹽類。紅霉素是白色或類白色的結晶性粉末，微有吸濕性，味苦，易溶于醇類、丙酮、氯仿、酯類（如乙酯、丁酯、戊酯等），微溶于乙醚。紅霉素在水中極微溶解，其溶解度隨溫度的升高而減小，以55℃時為最小。

紅霉素屬大環內酯類抗生素，大環內酯抗生素生物合成途徑由三個基本步驟組成：糖苷配基的形成；糖部分的生物合成和終端反應。該終端反應包括糖的連接和大環內酯中間體的一些細微變化。

前體是指加入到發酵培養基中的某些化合物，能被微生物直接結合到產物分子中去，而自身的結構無多大變化，且具有促進產物合成的作用。在大環內酯抗生素生物合成中，內酯環的形成往往是限制性因素。已知內酯環是以一些低級脂肪酸為前提單位所構成的，這些脂肪酸前體物，有的不易被菌體合成，因而就成為抗生素形成的限制性因素。正丙醇在發酵過程中的作用，一部分是用作合成紅霉內酯，因而對紅霉素的合成顯刺激作用，還有一部分是消耗于其他代謝途徑和損失。在紅霉素發酵過程中，加正丙醇作為生物合成的前體物質，可增加紅霉素產量。但是，在發酵前期加入正丙醇會干擾菌絲生長，從而降低抗生素的合成，外源前提在發酵液中的殘留濃度過高，會使生產菌中毒，不利于抗生素的合成。但前體不足也不行。因此，解決這兩者之間的矛盾，一個比較好的辦法就是提高紅霉素生產菌對正丙醇的耐受性，從而提高菌體產素能力。

發明內容

目前，提高紅霉素生產菌產紅霉素的能力，仍以誘變育種為主要手段。針對現有技術中存在的問題，本發明提供一種通過誘變提高紅霉素生產菌對正丙醇的耐受性，從而提高紅霉素產量的方法。

本發明的一種通過誘變提高紅霉素生產菌對正丙醇的耐受性的方法，其包括以下步驟：

（1）將紅霉素生產菌在斜面培養基上培養，培養7天后獲得新鮮成熟孢子；

（2）將紅霉素生產菌新鮮成熟斜面制成孢子懸液，孢子量在1×10⁶個/mL，取5mL孢子懸液移至培養皿中，于15W紫外線燈管和固定距離20cm照射3分鐘，誘變后進行梯度稀釋立即涂培養基平板；

（3）挑取步驟（2）誘變后活菌落進行離子束輻照誘變：誘變溫度為25℃，誘變劑量為55Gy，誘變后進行梯度稀釋涂培養基平板初篩。挑單菌落至斜面培養基，34℃，培養7天，再經搖瓶發酵方法進行復篩，所得突變菌即為對正丙醇具耐受性的高產紅霉素生產菌；

（4）步驟（1）或步驟（3）斜面養基的配方為：可溶性淀粉6g，玉米漿7g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g。步驟（2）的平板培養基的配方為：可溶性淀粉6g，玉米漿7g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，100%正丙醇15ml，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g；

（5）步驟（3）平板培養基配方為：可溶性淀粉6g，玉米漿7g，硫酸銨3g，氯化鈉3g，瓊脂粉20g，100%正丙醇20ml，加水定容至1000ml，調pH值至7.2，分析純碳酸鈣2.5g；

（6）步驟（3）的搖瓶發酵是將紅霉素生產菌在種子培養基中培養成熟的種子液接入發酵搖瓶培養基；

（7）步驟（3）種子培養基配方為：玉米淀粉28g，糊精7g，中溫黃豆餅粉12.6g，硫酸銨1.2g，硝酸銨1.2g，氯化鈉3g，玉米漿7.1g，分析純碳酸鈣6g，豆油2ml，加水定容至1000ml，調pH值至7.0。種子液培養條件為：34℃，220轉/分，振蕩培養42-46h；

（8）搖瓶發酵培養基配方為：玉米淀粉18g，糊精24g，中溫黃豆餅粉18g，硫酸銨2g，輕質碳酸鈣6g，豆油4ml，100%正丙醇20ml，加水定容至1000ml，調pH值至7.0；

（9）按照搖瓶發酵培養基配方配制搖瓶發酵液50mL，放入500mL帶擋板的三角瓶中；