[發明專利]單增李斯特氏菌核酸層析檢測試劑盒及其檢測方法和應用

無效

• 申請號: 201110410600.1
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102520172A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 王麗麗;趙瑜;唐慧林;何艷玲;李瑾
• 申請（專利權）人: 北京陸橋技術有限責任公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學和免疫學領域，涉及快速檢測食品中單增李斯特氏菌的試劑盒和方法。

背景技術

隨著國家對食品安全及進出口貿易的日益重視，對食品安全檢測技術的要求也越來越高。根據《國家中長期科學和技術發展規劃綱要(2006-2020年)》對公共安全領域中食品安全與出入境檢驗檢疫工作發展的要求，研究高效、快速、準確的檢測技術已成為該領域課題的主要趨勢和目標之一。

根據世界衛生組織掌握的資料，在食源性疾病危險因素中，微生物性食物中毒仍是首要危害；在我國，據中國疾病預防控制中心統計，我國流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒居首位，2006-2009年間每年所占比例分別為46.1％、37.1％和31.1％。單增李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜患病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李斯特氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，很多國家都已經采取措施來控制食品中的單增李斯特氏菌，并制定了相應的標準。

目前，致病微生物的檢測主要采用生物化學分析方法，但始終存在檢測耗時長等缺點，難以應付日益增多的檢測樣本量以及滿足檢驗檢疫工作高效率的要求。另一方面，隨著聚合酶鏈式反應(PCR)技術的應用，基于分子水平的檢驗檢疫技術得到了長足發展。熒光PCR方法除了需要高端的儀器設備外，使用的試劑價格昂貴，使得檢測成本大大提高，數據處理及結果判斷需要專業有經驗的技術人員，不適合進行廣泛的推廣；基因芯片技術不僅操作復雜，而且需要配備很多昂貴儀器，技術成本高，對實驗條件要求嚴，不利于普及推廣，結果判斷也不夠直觀；目前漸起的LAMP技術，由于靈敏度高，極易受到污染而產生假陽性結果，故要特別注意嚴謹操作，以及在產物的回收鑒定、克隆、單鏈分離方面均遜色于傳統的PCR方法，而且結果的判斷方法存在一定的缺陷。

普通PCR方法可以采用多種方法對擴增產物進行分析，最常用的包括：凝膠電泳分析、分子雜交、限制性內切酶分析、核酸序列分析。凝膠技術對相關人員及環境的毒害作用大，需要一系列復雜操作，而且點樣時操作誤差會使樣品漂移造成結果不準確，不適合進行大量樣本的檢測分析工作；分子雜交技術對操作人員技術要求較高，重現性不好；酶切分析技術操作復雜，增加污染幾率；核酸序列分析法周期長、成本高不能滿足快速檢測的需求。

發明內容

本發明解決的技術問題是提供食品中單增李斯特氏菌檢測用核酸層析試劑盒及其檢測方法和應用；發明主要目的在于克服傳統的微生物檢測方法存在檢測時間長、步驟繁瑣等缺陷，而提供一種更加快速、簡捷、安全的檢測試劑盒及其檢測方法。

本發明設計試劑盒既可以保證PCR技術的靈敏度和特異性，還保留了免疫層析技術所具備的高效、便捷、低成本等特點。

食品中單增李斯特氏菌檢測的試劑盒，包括細菌裂解液a、PCR反應液b、陰性對照品c、陽性對照品d、樣品稀釋液e和試紙條，所述試紙條所述試紙條由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上組成。結合墊上包被膠體金顆粒標記的鼠抗地高辛抗體，硝酸纖維素膜上有包被親和素的檢測線和包被羊抗鼠抗體的控制線；PCR反應液b中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F為5′CCCCAAGTAGCAGGACAT?3′，下游引物R為5′AGATTACACTGGATAATT3′；所述上游引物F標記生物素，下游引物R標記地高辛。

結合墊上包被膠體金顆粒粒徑為25nm，1mL膠體金顆粒標記8.4μg鼠抗地高辛抗體，形成的膠體金-抗體復合物在結合點墊上的包被量為2mL/30cm。

硝酸纖維素膜上檢測線包被親和素濃度為0.5mg/mL，包被量為1μL/cm；控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為1mg/mL，包被量為1μL/cm。

細菌裂解液a組成為：10mM?Tris-HCl，1％Triton-100pH7.0；

PCR反應液b組成如下：25μL反應體系包括以下組分

5×buffer?????????????????5μL；

dNTP(各2.5mmol/L)?????????2μL；

MgCl₂(25mmol/L)???????????2μL；

引物F(10umol/L)?????????0.5μL；

引物R(10umol/L)?????????0.5μL；

Taq?DNA聚合酶(5U/μL)???0.2μL；