[發明專利]β-1,4-內切甘露聚糖酶(Tvi Man5A)基因的克隆及重組酶的制備

無效

• 申請號: 201110410517.4
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102392036A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;閔柔;李劍芳;唐存多;胡蝶
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/885;C12R1/84
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技術領域

本發明涉及來源于綠色木霉(Trichoderma?viride)WL?0422的一種新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型β-甘露聚糖酶工程菌的構建，以及重組β-甘露聚糖酶的高效表達和純化的方法，屬于微生物基因工程技術領域。?

背景技術

β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan?mannohydrolase，EC?3.2.1.78)是一種能從均一甘露聚糖和異甘露聚糖主鏈的內部降解β-1，4-甘露糖苷鍵的水解酶，屬于半纖維素酶類，其廣泛地存在于微生物、植物和動物中。它可以廣泛應用于食品、醫藥、飼料、造紙、印染和石油工業等領域。在食品和醫藥領域，β-甘露聚糖酶作用于甘露聚糖后可以產生功能性低聚糖，這種低聚糖可以有效地降低人體血糖和膽固醇水平且有利于人和動物腸道內益生菌群的生長，進而調節人和動物的免疫系統、提高免疫力。在飼料工業中，它作為飼料添加劑能有效降解植物細胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗營養因子，提高能量利用率、改善飼料轉化率。在造紙工業中，β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶等半纖維素降解酶類協同使用，處理紙漿，能明顯改善紙質。將β-甘露聚糖酶運用紡織印染的漂白工藝中，能有效地去除產品上粘附的多余染料，更可以減少氯和堿的用量以及它們帶來的環境污染問題，有利于生態環境的保護。另外，在酶法降解可再生生物質資源生產燃料酒精的工藝中添加一定量的β-甘露聚糖酶可以促進可發酵糖的產生，進一步促進燃料酒精的生產，緩解全球的能源危機。目前已報道的能產β-甘露聚糖酶的微生物主要來自于細菌、真菌和放線菌，例如細菌中的枯草芽孢桿菌，真菌中的曲霉、木霉、青霉、酵母，以及放線菌中的鏈霉菌等。根據序列同源性和空間結構分析，多數β-甘露聚糖酶都屬于糖苷水解酶第5、26和113家族。目前，關于第5家族β-甘露聚糖酶的報道較多，它們的最適pH值為3.0～7.5，最適溫度在45～92℃。?

近年來，隨著對自然界中半纖維素資源的開發、飼糧中甘露聚糖抗營養因子的消除以及甘露寡糖生理功能的發現，β-甘露聚糖酶的需求量越來越大，導致對β-甘露聚糖酶的研究和開發進入一個新高潮。但就國內外相關文獻或專利報道來看，微生物β-甘露聚糖酶發酵酶活性普遍不高，導致了生產成本很高，從而阻礙了該酶在眾多領域中的廣泛應用。為了提高β-甘露聚糖酶的發酵產率和酶活性，早期的研究工作主要集中在產酶菌種的篩選、誘變、產酶誘導，酶的分離純化及性質，酶水解底物方式及應用等方面。進入90年代，隨著基因工程技術和蛋白質工程技術的廣泛應用，研究工作逐步轉向酶基因的克隆和表達以及酶活性位點的研究等方面。目前，雖已有一些有關β-甘露聚糖酶基因的克隆和表達的文獻和專利報道，但?有關來源于綠色木霉(Trichoderma?viride)β-甘露聚糖酶基因的克隆和表達等的研究未見有報道。?

發明內容

本發明的目的是提供一種新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型β-甘露聚糖酶工程菌的構建，以及重組β-甘露聚糖酶的高效表達和純化的方法。生物信息學分析表明來源于T.viride?WL?0422的一種新型β-甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶的第5家族，命名為Tvi?Man5A，其相應的基因命名為Tvi?man5A。Tvi?Man5A具有較高的催化活性和熱穩定性，有較大的工業化生產、應用潛力和經濟價值。?

本發明的技術方案：一種源自T.viride?WL?0422的新型β-甘露聚糖酶基因完整的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1。?

T.viride?WL?0422菌株由江南大學篩選和保藏，該菌株已于2006年在《江蘇食品與發酵》雜志的No.1Pg.1公開，本發明人承諾該菌株在20年內向公眾發放。?

所述的重組β-甘露聚糖酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。?

所述的重組β-甘露聚糖酶的活性測定方法：?

于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH?4.8、乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的質量濃度為0.5％的角豆膠溶液2.4mL，50℃預熱10min，在A管中加入0.1mL適當稀釋的酶液，50℃準確反應10min；立即各加入2.5mL?3′，5′-二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從甘露糖標準曲線上查出相應的還原糖(以甘露糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義：在本測定條件下，以每分鐘產生1μmol還原糖所需的酶量定義為1個β-甘露聚糖酶活性單位(IU)。?